Descrizione della analisi Come migliorare i metodi per l’estrazione cromosomi intatti dal lievito Come hanno scoperto che il donatore e riceventi micoplasmi condividono un sistema comune

Il nostro interesse nella sintesi di molecole di DNA di grandi dimensioni e cromosomi è cresciuto fuori dei nostri sforzi negli ultimi 15 anni per costruire una cella minimale che contiene solo i geni essenziali. Questo lavoro è stato inaugurato nel 1995 quando abbiamo sequenziato il genoma di Mycoplasma genitalium, un batterio con la più piccolo complemento dei geni di qualsiasi organismo noto  capace di una crescita indipendente in laboratorio. Oltre 100 dei 485 geni che codificano le proteine di M. genitalium sono dispensabile quando interrotto uno-a-un-tempo (4-6). Abbiamo sviluppato una strategia per l’assemblaggio di pezzi di dimensioni virale per la produzione di molecole di DNA di grandi dimensioni che ci ha permesso di assemblare genoma sintetico M. genitalium in quattro fasi, dalla cassette del DNA per sintesi chimica media di circa 6 kb nel formato. Ciò è stato realizzato attraverso una combinazione di enzimatici metodi in vitro e in vivo su ricombinazione Saccharomyces cerevisiae. L’intero genoma sintetico (582.970 bp) è stabilmente cresciuto come un lievito centromerica plasmide (YCP) (7). Molti ostacoli sono stati superati nel trapianto e esprimendo un cromosoma di sintesi chimica, in un cellula ricevente. Avevamo bisogno di migliorare i metodi per l’estrazione cromosomi intatti dal lievito. Abbiamo anche bisogno di imparare di trapiantare questi genomi in una cellula ricevente batterica stabilire una cella controllata solo da un genoma sintetico. A causa di il fatto che M. genitalium ha un tasso di crescita estremamente lenta, ci siamo rivolti a due specie di micoplasma più veloce crescita, M. mycoides sottospecie Capri (GM12) come donatore, e M. capricolum sottospecie capricolum (CK) come destinatario. Per stabilire le condizioni e le procedure per il trapianto fuori sintetico genoma del lievito, abbiamo sviluppato metodi per la clonazione intero cromosomi batterici come centromerica plasmidi di lievito di birra, tra cui un nativo M. mycoides genoma (8, 9). Tuttavia, i tentativi iniziali di estrarre il M. mycoides genoma di lievito e trapiantarla in capricolum M. fallito. Abbiamo scoperto che il donatore e ricevente micoplasmi condividono un sistema comune di restrizione.

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