Creazione di una cellula batterica controllata da una sintesi chimica del Genoma
Daniel G. Gibson, 1 Giovanni I. di vetro, 1 Carole Lartigue, 1 Vladimir N. Noskov, 1 Chuang Ray-Yuan, 1 Mikkel A. Algire, 1 Benders Gwynedd A., Michael G. Montecchi, 1 Ma Li, 1 Monzia M. Moodie, 1 Merryman Chuck, 1 2 Sanjay Vashee, 1 Krishnakumar Radha, 1 Nacyra Assad-Garcia, 1 Cynthia Andrews-Pfannkoch, 1 Evgeniya A. Denisova, 1 Lei giovane, 1 Qi Zhi-Qing, 1 H. Thomas Segall-Shapiro, 1 Christopher H. Calvey, 1 Prashanth P. Parmar, 1 Clyde A. Hutchison III, 2 Hamilton O. Smith, 2 J. Craig Venter1, 2 *
J. Craig Venter 1Il Institute, 9.704 Drive Medical Center, Rockville, MD 20850, USA. J. Craig Venter 2Il Institute, 10.355 Science Center Drive, San Diego, CA 92121, USA.
* A chi la corrispondenza deve essere affrontato. E-mail: jcventer@jcvi.org
Segnaliamo la progettazione, la sintesi e l’assemblaggio del 1,08- MBP Mycoplasma mycoides JCVI-syn1.0 genoma di partenza dalle informazioni digitalizzate sequenza del genoma e la sua trapianto in un destinatario Mycoplasma capricolum cella per creare nuovi Mycoplasma mycoides cellule che sono controllata solo dal cromosoma sintetico. L’unico DNA nelle cellule è il progettato sequenza di DNA sintetico, tra cui “filigrana” sequenze e altre iniziative volte delezioni e polimorfismi del gene e le mutazioni acquisite durante il processo di costruzione. Le nuove cellule sono attesi proprietà fenotipiche e sono in grado di continua auto-replicazione.
Nel 1977, Sanger e colleghi hanno determinato il completo codice genetico del fago fX174 (1), il genoma DNA primo ad essere completamente sequenziato. Diciotto anni dopo, nel 1995, il nostro team è stato in grado di leggere il primo codice genetico completo di un selfreplicating batterio Haemophilus influenzae (2). Lettura il codice genetico di una vasta gamma di specie è aumentata in modo esponenziale da questi primi studi. La nostra capacità di rapido digitalizzazione delle informazioni genomiche è aumentato di oltre il otto ordini di grandezza negli ultimi 25 anni (3). Gli sforzi per comprendere tutte queste nuove informazioni genomiche hanno generato numerosi nuovi paradigmi computazionali e sperimentali, tuttavia la nostra conoscenza genomica ancora molto limitata. Nessun singolo sistema cellulare ha tutti i suoi geni intesa in termini di il loro ruolo biologico. Anche in semplici cellule batteriche, effettuare le cromosomi contengono tutto il repertorio genetico? Se è così, può un sistema completo genetico essere riprodotto dalle chimica di sintesi, partendo con solo la sequenza del DNA digitalizzato contenute in un computer?
Il nostro interesse nella sintesi di molecole di DNA di grandi dimensioni e cromosomi è cresciuto fuori dei nostri sforzi negli ultimi 15 anni per costruire una cella minimale che contiene solo i geni essenziali. Questo lavoro è stato inaugurato nel 1995 quando abbiamo sequenziato il genoma di Mycoplasma genitalium, un batterio con la più piccolo complemento dei geni di qualsiasi organismo noto capace di una crescita indipendente in laboratorio. Oltre 100 dei 485 geni che codificano le proteine di M. genitalium sono dispensabile quando interrotto uno-a-un-tempo (4-6).
Abbiamo sviluppato una strategia per l’assemblaggio di pezzi di dimensioni virale per la produzione di molecole di DNA di grandi dimensioni che ci ha permesso di assemblare genoma sintetico M. genitalium in quattro fasi, dalla cassette del DNA per sintesi chimica media di circa 6 kb nel formato. Ciò è stato realizzato attraverso una combinazione di enzimatici metodi in vitro e in vivo su ricombinazione Saccharomyces cerevisiae. L’intero genoma sintetico (582.970 bp) è stabilmente cresciuto come un lievito centromerica plasmide (YCP) (7).
Molti ostacoli sono stati superati nel trapianto e esprimendo un cromosoma di sintesi chimica, in un cellula ricevente. Avevamo bisogno di migliorare i metodi per l’estrazione cromosomi intatti dal lievito. Abbiamo anche bisogno di imparare di trapiantare questi genomi in una cellula ricevente batterica stabilire una cella controllata solo da un genoma sintetico. A causa di il fatto che M. genitalium ha un tasso di crescita estremamente lenta, ci siamo rivolti a due specie di micoplasma più veloce crescita, M. mycoides sottospecie Capri (GM12) come donatore, e M. capricolum sottospecie capricolum (CK) come destinatario.
Per stabilire le condizioni e le procedure per il trapianto fuori sintetico genoma del lievito, abbiamo sviluppato metodi per la clonazione intero cromosomi batterici come centromerica plasmidi di lievito di birra, tra cui un nativo M. mycoides genoma (8, 9). Tuttavia, i tentativi iniziali di estrarre il M. mycoides genoma di lievito e trapiantarla in capricolum M. fallito. Abbiamo scoperto che il donatore e ricevente micoplasmi condividono un sistema comune di restrizione. Il donatore genoma è stato metilato nelle cellule native M. mycoides e è quindi protetto contro le restrizioni durante la trapianto da un donatore di cellule native (10). Tuttavia, il genomi batterici cresciuti in lievito sono metilato e quindi sono non protetti dal sistema di restrizione unico del cellula ricevente. Siamo stati in grado di superare questa limitazione
? barriera metilante il DNA donatore con purificato metilasi o greggio M. mycoides o estratti capricolum M., o semplicemente interrompere sistema di restrizione della cellula ricevente (8).
Ora abbiamo unito tutte le nostre precedentemente stabilito procedure e la relazione di sintesi, il montaggio, la clonazione, e trapianto con successo il 1,08-MBP M. mycoides JCVI-syn1.0 genoma, per creare una nuova cella controllata da questa genoma sintetico.
Risultati
Sintetico design genoma
Struttura della M. mycoides JCVI-syn1.0 genoma si è basata sul estremamente preciso finito sequenze del genoma di due ceppi di laboratorio di M. mycoides sottospecie GM12 Capri (8, 9) (11). Uno era il donatore del genoma usato da al Lartigue et al. [GenBank adesione CP001621] (10). L’altro era un ceppo creato da trapianto del genoma che era stata clonata e costruito nel lievito, YCpMmyc1.1-.typeIIIres, [GenBank adesione CP001668] (8). Questo progetto è stato criticamente dipende dalla precisione di queste sequenze. Anche se riteniamo che sia finito M. mycoides genoma sequenze sono affidabili, ci sono 95 siti in cui differiscono. Abbiamo iniziato a progettare il genoma sintetico prima che sia sequenze erano finiti. Di conseguenza, la maggior parte delle cassette sono stati progettati e sintetizzati basato sulla CP001621 sequenza (11). Quando è stato finito, abbiamo deciso di utilizzare la sequenza del genoma trapiantato con successo da lieviti (CP001668) come riferimento il nostro progetto (ad eccezione che abbiamo mantenuto la typeIIIres gene intatto). Tutte le differenze che apparivano biologicamente significative tra CP001668 e in precedenza cassette di sintesi sono stati corretti in modo che corrisponda esattamente (11). le differenze di sequenza tra le nostre cassette di sintesi e CP001668 che si sono verificati in 19 siti apparso innocuo, e così non sono stati corretti. Questi forniscono 19 polimorfica differenze tra il nostro genoma sintetico (JCVI-syn1.0) e la naturale (non sintetici) genoma (YCpMmyc1.1) che abbiamo hanno clonato nel lievito e utilizzare come standard per genoma trapianto da lievito (8). Per differenziare ulteriormente tra il genoma sintetico e quello naturale, quattro sequenze filigrana (fig. S1) sono stati progettati per sostituire una o cassette di più nelle regioni dimostrato sperimentalmente (Filigrane 1 [1246 bp] e 2 [1081 BP]) o la prevedibile (Filigrane 3 [1.109 bp] e 4 [1.222 bp]) non interferire con la vitalità cellulare. Queste sequenze filigrana codificare unico identificatori, pur limitando la loro traduzione in peptidi. Tavolo S1 elenca le differenze tra il genoma sintetico e questo standard naturale. Figura S2 mostra una mappa del M. mycoides JCVI-syn1.0 genoma. Casette e assemblaggio intermedio confini, filigrane, delezioni, inserzioni, e geni il M. mycoides JCVI syn1.0 sono mostrati in fig. S2, e il sequenza del clone micoplasma trapiantato sMmYCp235-1 è stato presentato alla GenBank (adesione # CP002027).
pSynthetic strategia di assemblaggio del genoma
Le cassette sono state generalmente progettate 1.080 bp a 80 bp sovrappone a cassette adiacenti (11). Essi sono stati tutti prodotti da assemblaggio di oligonucleotidi sintetizzati chimicamente da Blue Heron, Bothell, Washington. Ogni cassetta è stata individualmente sintetizzato e sequenza verificato dal costruttore. A aiuto nel processo di costruzione, cassette di DNA e l’assemblaggio intermedi sono stati progettati per contenere Non io restrizione siti a loro termini, e ricombinati alla presenza del vettore elementi per consentire la crescita e la selezione in lievito (7) (11).
pA strategia gerarchico è stato progettato per assemblare il genoma in 3 fasi per la trasformazione e omologhi ricombinazione in lievito 1.078 cassette da un kb (Fig. 1) (12, 13).
Assemblea degli intermedi sintetici di 10 kb. Nel primo fase, cassette e un vettore sono stati ricombinati in lievito e trasferiti a E. coli (11). DNA del plasmide è stato quindi isolato da singoli cloni di E. coli e digerito allo schermo per le cellule contenente un vettore con un inserto montato 10-kb. Uno successo di montaggio di 10 kb è rappresentato (Fig. 2a). In generale, almeno un frammento di 10 kb potrebbe essere assemblata ottenuti dallo screening 10 cloni di lievito. Tuttavia, il tasso di successo varia dal 10-100%. Tutte le prima fase intermedi sono stati sequenziati. Diciannove su 111 assemblee conteneva errori. Alternate cloni sono stati selezionati, Sequenza-verificati, e si è trasferito al prossima assemblea fase (11).
Assemblea degli intermedi sintetici da 100 kb. Il pool 10-KB assemblee e dei loro vettori di clonazione sono stati rispettivamente trasformato in lievito come sopra per la produzione di montaggio 100 kb intermedie (11). I nostri risultati indicano che i prodotti non può essere mantenuto stabilmente in E. coli DNA ricombinato in modo doveva essere estratto dal lievito. Multiplex PCR è stata effettuata su cloni lieviti selezionati (fig. S3 e S2 tabella). Perché ogni 10 KB di assemblaggio intermedio era rappresentata da una coppia di primer in questa analisi, la presenza di tutti ampliconi suggerirebbe un concentrato di 100 kb intermedi. In generale, il 25% o più dei cloni selezionati conteneva tutti gli ampliconi previsto per un montaggio completo. Uno di questi cloni è stato selezionate per ulteriori controlli. Circolare plasmide DNA è stato estratti e imprese su un gel di agarosio accanto ad un supercoiled marker. Il successo assemblee di seconda fase con il vettore sequenza sono circa 105 kb di lunghezza (fig. 2b). Quando tutti ampliconi sono stati prodotti PCR multiplex, un assemblea di seconda fase intermedia della dimensione corretta era solitamente prodotte. In alcuni casi, tuttavia, piccole delezioni si è verificato. In altri casi, più frammenti di 10 kb sono stati assemblati, che ha prodotto un più grande assemblea di seconda fase intermedi. Fortunatamente, queste differenze potrebbero essere facilmente
? rilevati su un gel di agarosio prima completa del genoma montaggio.
Completare il montaggio del genoma. In preparazione per la finale fase di montaggio, è stato necessario isolare microgrammi quantitativi di ciascuna delle assemblee 11 secondo stadio (11). Come segnalati (14), plasmidi circolare le dimensioni della nostra seconda fase assemblee poteva essere isolato dal sferoplasti lievito dopo un alcalino-lisi procedura. Per purificare ulteriormente le 11 assemblea intermedi, sono stati trattati con exonuclease e passato attraverso una colonna a scambio anionico. Una piccola frazione del totale di DNA del plasmide (1/100th) è stato digerito con Not I e analizzati mediante elettroforesi su gel a campo-inversione (FIGE) (Fig. 2c). Questo metodo produce ~ 1 mg di ogni assemblea per 400 lievito madre ml (~ 1011 celle).
Il metodo di cui sopra non rimuove completamente tutti i lievito DNA cromosomico lineare, che abbiamo trovato possa ridurre notevolmente la trasformazione del lievito e il montaggio efficienza. Per arricchire ulteriormente per l’assemblaggio undici circolare intermedi, ~ 200 campioni ng di ogni assemblea sono stati riunite e mescolate con agarosio fuso. Come l’agarosio solidifica, il filo attraverso le fibre e topologicamente “trappola” DNA circolare (15). DNA non catturato lineare può essere elettroforesi su agarosio la spina, arricchendo così la intrappolate molecole circolari. L’assemblea undici circolare intermedi sono stati digeriti con Non io in modo che gli inserti potrebbe essere rilasciato. In seguito, frammenti furono estratta dalla presa di agarosio, analizzata da FIGE (Fig. 2d), e trasformata in sferoplasti lievito (11). In questa terza e fase finale di montaggio, una sequenza di vettore aggiuntivo non è stato richiesto, poiché il lievito clonazione elementi sono stati già presenti in assemblea 811-900.
Per schermo per un genoma completo, PCR multiplex è stata effettuato con 11 coppie di primer, progettato per occupare ciascuno dei undici svincoli di montaggio di 100 kb (S3 tabella). Di 48 colonie schermato, DNA estratto da un clone (sMmYCp235) prodotte tutte le 11 ampliconi. PCR di tipo selvatico (WT) controllo positivo (YCpMmyc1.1) ha prodotto un insieme indistinguibile di 11 ampliconi (Fig. 3a). Per ulteriori dimostrare l’assemblaggio completo di un sintetico M. mycoides genoma, il DNA intatto è stato isolato da lievito in spine agarosio e sottoposto a due analisi di restrizione; Asc I BssH e II (11). Dato che questi siti di restrizione sono presenti in tre delle quattro sequenze di filigrana, questa scelta di digestione produce modelli di restrizione che si distinguono dai il naturale M. mycoides genoma (figg. 1 e 3b). Il sMmYCp235 clone prodotto il profilo di restrizione attesi per un genoma sintetico completamente montato (Fig. 3c).
pSynthetic trapianto di genoma
spine agarosio Ulteriori utilizzati per l’analisi di gel sopra (Fig. 3c) sono stati utilizzati anche in esperimenti di trapianto del genoma (11). Intatto genoma sintetico signor mycoides dal sMmYCp235 clone lievito sono stati trapiantati in restrictionminus M. capricolum cellule riceventi, come descritto (8). Risultati sono stati segnati da selezionare per la crescita di colonie blu sulla SP4 supporto contenente tetraciclina e X-gal a 37 ° C. Genomi isolati da questo clone lievito ottenuto tetracyclineresistant 5-15 colonie blu per agarosio spina. Questo è stato comparabile al controllo YCpMmyc1.1. Il recupero delle colonie in tutti i esperimenti di trapianto è stato dipendente dalla presenza di entrambe le celle M. destinatario capricolum e un M. mycoides genoma.
Semi-sintetico di assemblaggio e il trapianto di genoma
Per facilitare la verifica della funzionalità di ogni 100 kb sintetico genomi segmento, semi-sintetico sono state costruite e trapiantati. Miscelando pezzi naturali con quelli sintetici, la costruzione di successo di ogni assemblea sintetico da 100 kb hanno potuto essere verificate, senza dover sequenza di queste intermedi. Abbiamo clonato 11 sovrapposizione naturale da 100 kb assemblee in lievito utilizzando un metodo precedentemente descritto (16). In 11 reazioni parallele, cellule di lievito sono stati co-trasformato con M. mycoides frammentato genomic DNA (YCpMmyc 1.1) che in media ~ 100 kb di lunghezza e una PCR-amplificato vettore progettati per sovrapporsi alle estremità degli inserti di 100 kb. A mantenere le sovrapposizioni appropriate affinché naturali e sintetici frammenti possono essere ricombinati, i vettori PCR-amplificato sono stati prodotti tramite iniettori con le sovrapposizioni di 40 bp stesso usato per clonare le assemblee di 100 KB di sintesi. Il semi-sintetico genomi che sono stati costruiti contenuta tra due e dieci degli undici sottoinsiemi di 100 kb di sintesi (tabella 1). La produzione di colonie vitali prodotti dopo trapianto, ionfirmed che la frazione di sintesi di ogni genoma non contiene mutazioni letali. Solo uno dei 100 – sottoinsiemi kb, 811-900, non era praticabile.
Inizialmente, un messaggio di errore contenente 811-820 clone è stato utilizzato per produrre un genoma sintetico che non il trapianto. Questo è stato atteso poiché l’errore è stato un unico cancellazione coppia di basi che crea un frameshift in dnaA, un gene essenziale per replicazione dei cromosomi. Eravamo già a conoscenza di questa mutazione. Utilizzando una costruzione semi-sintetico del genoma strategia, siamo stati in grado di individuare 811-900 come origine per fallito esperimenti di trapianto di sintesi. Così, abbiamo iniziato di rimontare un errore privo di 811-900 assemblea, che è stato utilizzati per produrre lo sforzo sMmYCp235 lievito. Il dnaAmutated genoma differisce solo per un nucleotide del genoma sintetico in sMmYCp235. Questo genoma servito da controllo negativo nei nostri esperimenti di trapianto. Il dnaA mutazione è stata riparata anche a livello di 811-900 da genoma ingegneria nel lievito (17). Un assembly è stato riparato 811-900 utilizzato in una fase finale di assemblaggio per produrre un clone di lievito con un riparazione del genoma. Questo clone è chiamato lievito sMmYCP142 e potrebbero essere trapiantati. Un elenco completo dei genomi che
? sono stati assemblati da 11 pezzi e con successo trapiantato è previsto nella tabella 1.
Caratterizzazione dei trapianti di sintesi
Per distinguere rapidamente i trapianti di sintesi provenienti da M. capricolum o naturale mycoides M., due analisi sono state eseguita. In primo luogo, quattro coppie di primer che sono specifici per ciascuna delle i quattro filigrane sono stati progettati in modo tale che essi producono ampliconi quattro in una singola reazione di PCR multiplex (tabella S4). Tutti e quattro gli ampliconi sono stati prodotti da trapianto generata da sMmYCp235, ma non YCpMmyc1.1 (Fig. 4a). In secondo luogo, l’analisi gel con Asc I e II BssH, descritto in precedenza (Fig. 3D), è stata effettuata. Il pattern di restrizione ottenuto è stato coerente con un trapianto di prodotto da un sintetico M. mycoides genoma (Fig. 4b).
Un trapianto singolo provenienti dal sMmYCp235 genoma sintetico è stato sequenziato. Ci riferiamo a questo ceppo di M. mycoides JCVI-syn1.0. La sequenza ha riscontrato l’intesa design con l’eccezione dei polimorfismi noti, 8 nuovi polimorfismi di singoli nucleotidi, un trasposone E. coli inserimento, e di una duplicazione di 85 bp (tabella S1). I trasposoni inserimento corrisponde esattamente la dimensione e la sequenza di IS1, un trasposone in E. coli. E ‘probabile che IS1 infetto il 10-KB sub-assemblaggio seguito del suo trasferimento in E. coli. L’inserto IS1 è fiancheggiata da ripetizioni dirette di M. mycoides successione suggerendo che è stato inserito da un meccanismo di recepimento. La duplicazione di 85 bp è il risultato di un non-omologa end evento che unisce, non è stata rilevata nella nostra sequenza analisi in fase di 10 kb. Questi due inserimenti disturbare due geni che sono evidentemente non essenziali. Non abbiamo trovato alcuna le sequenze del genoma sintetico che potrebbe essere identificata come appartenenti a capricolum M.. Questo indica che c’è stato un la sostituzione completa del genome capricolum M. dal nostro genoma sintetico durante il processo di trapianto.
Le celle con solo il genoma sintetico sono auto replica e capace di una crescita logaritmica. Scansione e microscopio elettronico a trasmissione (EM) di M. mycoides JCVI-syn1.0 celle mostrano piccole celle ovoidale circondato da membrane citoplasmatica (Fig. 5c-5F). Analisi di proteomica M. mycoides JCVI-syn1.0 e il WT di controllo (YCpMmyc1.1) di due-dimensionale elettroforesi su gel rivelato pressoché identico pattern di macchie proteine (fig. S4) e questi erano chiaramente diversi da quelli precedentemente riportati per capricolum M. (10). Quattordici i geni sono soppresse o interrotto in M. mycoides JCVI-syn1.0 genoma, Tuttavia, il tasso di comparsa di colonie su piastre di agar e la morfologia delle colonie sono simili (confronta fig. 5a e b). Abbiamo fatto osservare differenze nei tassi di crescita in un colore fasciatoio test, con la JCVI-syn1.0 trapianti crescita leggermente più veloce rispetto al controllo MmcyYCp1.1 ceppo (Fig. S6).
Discussione
Nel 1995, lo standard di qualità per il sequenziamento è stato considerato da un errore su 10.000 bp e il sequenziamento di un microbica mesi genoma richiesto. Oggi, la precisione è decisamente più elevati. copertura del genoma di 30-50X non è insolito e sequenziamento richiede solo pochi giorni. Tuttavia, ottenere un genoma privo di errori che potrebbero essere trapiantate in destinatario di una cella per creare una nuova cella controllata solo dalla genoma sintetico è stato complicato e ha richiesto molte qualità controllo passi. Il nostro successo è stato sventato per molte settimane da un singola coppia di soppressione di base per le dnaA gene essenziale. Uno base sbagliata su oltre un milione in un gene essenziale rese inattivo il genoma, mentre i principali inserimenti genoma e le eliminazioni nelle parti non essenziali del genoma non ha avuto conseguenze osservabili redditività. La dimostrazione che la nostra genoma sintetico dà luogo a trapianto con la caratteristiche delle cellule M. mycoides implica che il DNA sequenza su cui si basa è abbastanza accurati da specificare una cellula vivente, con le proprietà appropriate.
Il nostro approccio sintetico genomica sta in netto contrasto con una varietà di approcci diversi al genoma di ingegneria che modificare genomi naturali con l’introduzione di inserimenti multipli, sostituzioni o eliminazioni (18-22). Questo lavoro fornisce un prova di principio per la produzione di celle sulla base genoma sequenze progettate nel computer. sequenziamento del DNA di un genoma cellulare consente la memorizzazione delle istruzioni genetiche per la vita come un file digitale. Il genoma sintetico descritto in questo carta è solo modifiche limitate dalla natura che si verificano M. mycoides genoma. Tuttavia, l’approccio che abbiamo hanno messo a punto dovrebbero essere applicabili alla sintesi e trapianto di genomi romanzo più come design genoma avanza (23).
Ci riferiamo a una tale cella controllata da un genoma assemblato da sintesi chimica pezzi di DNA come un “sintetico cella “, anche se il citoplasma della cellula ricevente non è sintetico. effetti fenotipici del citoplasma destinatario sono diluito con un fatturato di proteine e le cellule che trasportano solo il trapiantati genoma replicare. A seguito di trapianto e replica su un piatto a formare una colonia (> 30 divisioni o> 109 diluizione volte), la progenie non conterrà molecole di proteina che erano presenti nella cella originale destinatario (10, 24). Questo è stato precedentemente dimostrato quando abbiamo descritto genoma trapianto (10). Le proprietà delle cellule controllata da il genoma assemblato dovrebbero essere gli stessi, come se il cellula intera era stata prodotta sinteticamente (il DNA software costruisce il proprio hardware).
Il tp capacità di produrre cellule sintetiche lo rende essenziale per i ricercatori rendere DNA sintetico costrutti e delle cellule chiaramente filigrana il loro lavoro per distinguerla dalla natura che si verificano sul DNA e delle cellule. Abbiamo filigrana il sintetico cromosoma in questo e il nostro precedente studio (7).
? Se i metodi qui descritti possono essere generalizzate, design, sintesi, assemblaggio, e il trapianto di sintesi cromosomi non sarà più un ostacolo al progresso della biologia sintetica. Ci aspettiamo che il costo della sintesi del DNA seguirà quello che è successo con il sequenziamento del DNA e continuano a diminuire in modo esponenziale. Abbassare i costi di sintesi combinato con l’automazione consentirà di massima per le applicazioni genomica sintetica.
Siamo stati la guida del dibattito etico in materia vita sintetica dalle prime fasi di questo lavoro (25, 26). Come applicazioni di genomica sintetica espandersi, possiamo anticipare che questa il lavoro continuerà a sollevare questioni filosofiche che hanno ampio implicazioni sociali ed etiche. Incoraggiamo l’ discorso continuato.
Riferimenti e note
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2. Fleischmann RD et al. Science 269, 496 (28 lug 1995).
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6. HO Smith, Glass JI, CA Hutchison III, JC Venter, Accesso a microrganismi Incolto: Dalla Ambiente per gli organismi e genomi e Back K. Zengler, Ed. (ASM Press, Washington, 2008), pp. 320.
7. DG Gibson et al. Science 319, 1215 (Feb 29, 2008).
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11. Ulteriori informazioni sono disponibili su Science Online.
12. DG Gibson, Acidi Nucleici 37, 6.984 (, novembre 2009).
13. DG Gibson et al. Proc Natl Acad Sci USA 105, 20.404 (23 dicembre 2008).
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20. H. Mizoguchi, H. Mori, T. Fujio, biotecnologie Appl Biochem 46, 157 (Mar, 2007).
21. Chun JY et al. Acidi Nucleici 35, E40 (2007).
22. HH Wang et al., Nature 460, 894 (13 agosto 2009).
23. Collins Khalil, JJ, Nat Genet Ap 11, 367 (maggio).
24. Una cellula micoplasma, con una massa di cellule di circa 10-13 g, contiene meno di 106 molecole di proteina. (Se contiene il 20% di proteine si tratta di 2 x 10-14 g di proteine per cella. A un peso molecolare di 120 dalton per residui di aminoacidi ogni cella contiene (2 x 10-14) / 120 = 1.7 x 10-16 moli di peptide residui. Questo è di 1,7 x 10-16 x 6 x 1023 = 1 x 108 residui per cella. Se la dimensione media di una proteina è di 300 residui allora una cella contiene circa 3 x 105 proteine molecole.) Dopo 20 divisioni cellulari il numero di discendenti supera il numero totale di molecole proteiche presenti nel la cellula ricevente. Così, dopo il trapianto e replica a formare una colonia su un piatto, la maggior parte delle cellule si non contengono molecole proteiche che erano presenti nel originale cellula ricevente.
25. MK Cho, D. Magnus, Caplan AL, D. McGee, Scienza 286 del 2087 (10 Dicembre 1999).
26. MS Garfinkel, D. Endy, Epstein GE, Friedman RM. (2007).
27. DG Gibson et al. Metodi Nat 6, 343 (maggio 2009).
28. Ringraziamo Synthetic Genomics, Inc. per il generoso finanziamento di questo lavoro. Ringraziamo J. B. Hostetler, D. Radune, N. B. Fedorova, Kim MD, BJ Szczypinski, Singh IK, JR Miller, S. Kaushal, Friedman RM, e J. Mulligan per il loro contributo a questo lavoro. Electron micrografie sono stati gentilmente forniti da T. Deerinck e M. Ellisman del Centro nazionale per la microscopia e Imaging Ricerca presso l’Università della California a San Diego. J.C.V. è Chief Executive Officer e Co-direttore scientifico Officer di SGI. H.O.S. è Co-Direttore Scientifico e il Consiglio di Amministrazione di SGI. C.A.H. è presidente della SGI il Comitato Scientifico. Tutti e tre questi autori e JCVI detenere stock SGI. JCVI ha depositato brevetti applicazioni su alcune delle tecniche descritte nel presente carta.
Materiale di supporto online http://www.sciencemag.org/cgi/content/full/science.1190719/DC1
Materiali e Metodi
Fichi. S1 a S6
Tavoli da S1 a S7
Riferimenti
9 aprile 2010; accettato 13 Maggio 2010 Pubblicato online il 20 maggio 2010; 10.1126/science.1190719 Includere queste informazioni quando citando questo articolo.
Fig. 1. Il montaggio di una sintetica M. mycoides genoma in lievito. Un genoma sintetico M. mycoides è stato assemblato da 1.078 cassette di DNA sovrapposti in tre fasi. Nel primo passo, 1.080-bp cassette (frecce arancioni), prodotto da sovrapposizione oligonucleotidi sintetici, sono stati ricombinati in confezioni da 10 pezzi per la produzione di assemblaggi 109 ~ 10 KB (Frecce blu). Questi sono stati poi ricombinati in confezioni da 10 a produrre undici assemblee ~ 100 KB (frecce verdi). Nel fase finale di montaggio, questi frammenti undici ricombinato nel genoma completo (cerchio rosso). Con l’
? tranne il 2 costrutti che sono stati enzimaticamente pieced insieme in vitro (27) (frecce bianche), le assemblee sono state effettuate da in vivo ricombinazione omologa in lievito. Grande variazioni rispetto al genoma naturale sono mostrati in giallo cerchi. Questi includono 4 Regioni filigranata (WM1-WM4), una regione da 4 KB che è stato volutamente cancellato (94 quinquies), e elementi per la crescita nel lievito e il trapianto di genoma. In Inoltre, vi sono 20 località con nucleotide polimorfismi (asterischi). Coordinate del genoma sono rispetto al primo nucleotide del M. mycoides naturale sequenza. La sequenza è progettato 1.077.947 bp. Il I luoghi della Asc e BssH siti di restrizione II sono mostrate. Cassette 1 e 800-810 sono stati inutili e rimossi dal la strategia di assemblaggio (11). Cassetta 2 sovrapposizioni cassette 1104 799 e cassette sovrapposizioni cassetta 811.
Fig. 2. L’analisi degli intermedi di montaggio. (A) Non io e SBF faccio doppio digestione analisi di restrizione di montaggio 341 – 350 purificato da E. coli. Questi enzimi di restrizione di rilascio i frammenti vettore (5,5 kb e 3,4 kb) dal-10 kb Inserisci. Inserisci il DNA è stato separato dal DNA di vettore su un 0,8% E-gel (Invitrogen). M indica la scala del DNA di 1 kb (Biolabs New England, NEB). (B) Analisi del montaggio 501 – 600 purificato da lievito. I cerchi a 105 kb (100 kb inserire più 5-kb vettore) sono stati separati dal lievito lineare DNA cromosomico di un 1% gel mediante l’applicazione di 4,5 V / cm per 3 ore. S indica il BAC-Tracker supercoiled DNA ladder (Epicentre). (C) Non ho restrizione digestione analisi delle undici assemblee ~ 100 kb purificato da lievito. Questi frammenti di DNA sono stati analizzati da FIGE su un 1% gel di agarosio. Le dimensioni inserto previsto per ogni assemblea è indicato. . indica la scala lambda (NEB). (D) Analisi delle 11 assemblee riunite in (c) a seguito cattura topologiche del DNA circolare e non ho la digestione. Un quarantesimo del DNA usato per trasformare il lievito è rappresentati.
Fig. 3. Caratterizzazione del genoma sintetico isolato dal lievito. (A) cloni di lievito contenente una completamente assemblato genoma sintetici sono stati esaminati da PCR multiplex con un primer set che produce 11 ampliconi, uno in ciascuna delle 11 montaggio dei raccordi. Lievito clone sMmYCp235 (235) prodotto i 11 prodotti di PCR attesi per una completa assemblaggio del genoma. Per confronto, il genoma naturale estratto dal lievito (WT) è stato anche analizzato. Prodotti di PCR sono stati separati su un 2% E-gel (Invitrogen). L indica il 100-bp ladder (NEB). (B) Le dimensioni del previsto Asc I e BssH frammenti di restrizione II per naturale (WT) e sintetiche (Syn235) M. mycoides genomi. (C) Naturale (WT) e sintetici (235) M. mycoides genomi sono stati isolati da lievito in spine agarosio. Inoltre, il DNA è stato purificato da il ceppo ospite da solo (H). tappi di agarosio sono stati digeriti con Asc I o II BssH e frammenti sono stati separati da serrate omogenea campo elettrico (Chef) elettroforesi su gel. Frammenti di restrizione corrispondenti alle dimensioni corrette sono indicato dai numeri frammento mostrato in (b).
Fig. 4. Caratterizzazione dei trapianti. (A) Trapianti contenente un genoma sintetico sono stati esaminati da multiplex PCR con un set di primer che produce 4 ampliconi, uno interno a ciascuno dei quattro filigrane. Un trapianto (syn1.0) provenienti da lievito clone sMmYCp235 è stato analizzato accanto ad una naturale, genoma non sintetici (WT) trapiantati di lievito. Il trapianto del genoma sintetico contenente prodotto i 4 prodotti PCR mentre il genoma WT ha non producono alcun. I prodotti di PCR sono stati separati su un 2% E-gel (Invitrogen). (B) Naturale (WT) e sintetiche (syn1.0) M. mycoides genomi sono stati isolati da M. mycoides trapianti di spine agarosio. spine agarosio sono stati digeriti con Asc I o II BssH e frammenti sono stati separati da CHEF elettroforesi su gel. Frammenti di restrizione corrispondenti a le dimensioni corrette sono indicate con i numeri frammento mostrato in fig. 3 ter.
Fig. 5. Immagini di M. mycoides JCVI-syn1.0 e WT M. mycoides. Per confrontare il fenotipo del JCVI-syn1.0 e non YCP ceppi WT, abbiamo esaminato la morfologia colonia placcatura cellule su piastre contenenti agar SP4 X-gal. Tre giorni dopo la placcatura, il syn1.0 colonie JCVI sono blu perché il cellule contengono il gene lacZ ed esprimere la beta-galattosidasi, che converte l’X-gal di un composto blu (a). Il WT le cellule non contengono lacZ e rimangono bianche (b). Entrambi i cellulari i tipi hanno la caratteristica uovo fritto colonia morfologia del maggior parte dei micoplasmi. EMs sono state fatte delle JCVI-syn1.0 isolare utilizzando due metodi. (C) per la scansione EM, i campioni sono stati post-fissati in tetrossido di osmio, disidratata e critica punto secco con la CO2, e visualizzati utilizzando un SU6600 Hitachi SEM del 2,0 keV. (D) EMS trasmissione Negativamente macchiato di cellule in divisione con 1% di acetato di uranile in carbonio puro substrato visualizzato per mezzo di JEOL 1200EX CTEM a 80 keV. Per esaminare la morfologia delle cellule, abbiamo confrontato di acetato di uranile EM macchiato di M. mycoides JCVI-syn1.0 cellule (e) con EMS di cellule WT effettuati nel 2006 che sono stati colorati con ammonio molibdato (f). Entrambi i tipi di cellule mostrano la stessa ovoidale morfologia e l’aspetto generale. EM sono stati forniti da Tom Deerinck e Ellisman Mark of the National Center for Microscopia e Imaging Research presso l’Università di California a San Diego.
? Tabella 1. Genomi che sono stati assemblati da 11 pezzi e trapiantate con successo. Assemblea 200-100 = 1, il montaggio 101 – 200 = 2, assemblea 201-300 = 3, 301-400 = 4 montaggio, assemblaggio 401-500 = 5, assemblea 501-600 = 6, il montaggio 601-700 = 7, montaggio 701-799 = 8, il montaggio 811-900 = 9, assemblea 901-1.000 = 10, assemblea 1001-1104 = 11. WM indica filigranata montaggio.
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