Creazione di una cellula batterica controllata da una sintesi chimica del Genoma

Creazione di una cellula batterica controllata da una sintesi chimica del Genoma
Daniel G. Gibson, 1 Giovanni I. di vetro, 1 Carole Lartigue, 1 Vladimir N. Noskov, 1 Chuang Ray-Yuan, 1 Mikkel A.
Algire, 1 Benders Gwynedd A., Michael G. Montecchi, 1 Ma Li, 1 Monzia M. Moodie, 1 Merryman Chuck, 1 2
Sanjay Vashee, 1 Krishnakumar Radha, 1 Nacyra Assad-Garcia, 1 Cynthia Andrews-Pfannkoch, 1 Evgeniya A.
Denisova, 1 Lei giovane, 1 Qi Zhi-Qing, 1 H. Thomas Segall-Shapiro, 1 Christopher H. Calvey, 1 Prashanth P.
Parmar, 1 Clyde A. Hutchison III, 2 Hamilton O. Smith, 2 J. Craig Venter1, 2 *
J. Craig Venter 1Il Institute, 9.704 Drive Medical Center, Rockville, MD 20850, USA. J. Craig Venter 2Il Institute, 10.355
Science Center Drive, San Diego, CA 92121, USA.
* A chi la corrispondenza deve essere affrontato. E-mail: jcventer@jcvi.org
Segnaliamo la progettazione, la sintesi e l’assemblaggio del 1,08-
MBP Mycoplasma mycoides JCVI-syn1.0 genoma di partenza
dalle informazioni digitalizzate sequenza del genoma e la sua
trapianto in un destinatario Mycoplasma capricolum
cella per creare nuovi Mycoplasma mycoides cellule che sono
controllata solo dal cromosoma sintetico. L’unico
DNA nelle cellule è il progettato sequenza di DNA sintetico,
tra cui “filigrana” sequenze e altre iniziative volte
delezioni e polimorfismi del gene e le mutazioni
acquisite durante il processo di costruzione. Le nuove cellule sono
attesi proprietà fenotipiche e sono in grado di
continua auto-replicazione.
Nel 1977, Sanger e colleghi hanno determinato il completo
codice genetico del fago fX174 (1), il genoma DNA primo ad essere
completamente sequenziato. Diciotto anni dopo, nel 1995, il nostro team
è stato in grado di leggere il primo codice genetico completo di un selfreplicating
batterio Haemophilus influenzae (2). Lettura
il codice genetico di una vasta gamma di specie è aumentata
in modo esponenziale da questi primi studi. La nostra capacità di rapido
digitalizzazione delle informazioni genomiche è aumentato di oltre il
otto ordini di grandezza negli ultimi 25 anni (3). Gli sforzi
per comprendere tutte queste nuove informazioni genomiche hanno generato
numerosi nuovi paradigmi computazionali e sperimentali,
tuttavia la nostra conoscenza genomica ancora molto limitata. Nessun singolo
sistema cellulare ha tutti i suoi geni intesa in termini di
il loro ruolo biologico. Anche in semplici cellule batteriche, effettuare le
cromosomi contengono tutto il repertorio genetico? Se è così, può
un sistema completo genetico essere riprodotto dalle chimica
di sintesi, partendo con solo la sequenza del DNA digitalizzato
contenute in un computer?
Il nostro interesse nella sintesi di molecole di DNA di grandi dimensioni e
cromosomi è cresciuto fuori dei nostri sforzi negli ultimi 15 anni per
costruire una cella minimale che contiene solo i geni essenziali. Questo
lavoro è stato inaugurato nel 1995 quando abbiamo sequenziato il
genoma di Mycoplasma genitalium, un batterio con la
più piccolo complemento dei geni di qualsiasi organismo noto
capace di una crescita indipendente in laboratorio. Oltre
100 dei 485 geni che codificano le proteine di M. genitalium sono
dispensabile quando interrotto uno-a-un-tempo (4-6).
Abbiamo sviluppato una strategia per l’assemblaggio di pezzi di dimensioni virale
per la produzione di molecole di DNA di grandi dimensioni che ci ha permesso di assemblare
genoma sintetico M. genitalium in quattro fasi, dalla
cassette del DNA per sintesi chimica media di circa 6 kb
nel formato. Ciò è stato realizzato attraverso una combinazione di
enzimatici metodi in vitro e in vivo su ricombinazione
Saccharomyces cerevisiae. L’intero genoma sintetico
(582.970 bp) è stabilmente cresciuto come un lievito centromerica
plasmide (YCP) (7).
Molti ostacoli sono stati superati nel trapianto e
esprimendo un cromosoma di sintesi chimica, in un
cellula ricevente. Avevamo bisogno di migliorare i metodi per l’estrazione
cromosomi intatti dal lievito. Abbiamo anche bisogno di imparare
di trapiantare questi genomi in una cellula ricevente batterica
stabilire una cella controllata solo da un genoma sintetico. A causa di
il fatto che M. genitalium ha un tasso di crescita estremamente lenta,
ci siamo rivolti a due specie di micoplasma più veloce crescita, M.
mycoides sottospecie Capri (GM12) come donatore, e M.
capricolum sottospecie capricolum (CK) come destinatario.
Per stabilire le condizioni e le procedure per il trapianto
fuori sintetico genoma del lievito, abbiamo sviluppato metodi per la
clonazione intero cromosomi batterici come centromerica
plasmidi di lievito di birra, tra cui un nativo M. mycoides genoma (8,
9). Tuttavia, i tentativi iniziali di estrarre il M. mycoides
genoma di lievito e trapiantarla in capricolum M.
fallito. Abbiamo scoperto che il donatore e ricevente
micoplasmi condividono un sistema comune di restrizione. Il donatore
genoma è stato metilato nelle cellule native M. mycoides e
è quindi protetto contro le restrizioni durante la
trapianto da un donatore di cellule native (10). Tuttavia, il
genomi batterici cresciuti in lievito sono metilato e quindi sono
non protetti dal sistema di restrizione unico del
cellula ricevente. Siamo stati in grado di superare questa limitazione
?
barriera metilante il DNA donatore con purificato
metilasi o greggio M. mycoides o estratti capricolum M.,
o semplicemente interrompere sistema di restrizione della cellula ricevente
(8).
Ora abbiamo unito tutte le nostre precedentemente stabilito
procedure e la relazione di sintesi, il montaggio, la clonazione, e
trapianto con successo il 1,08-MBP M. mycoides
JCVI-syn1.0 genoma, per creare una nuova cella controllata da questa
genoma sintetico.
Risultati
Sintetico design genoma
Struttura della M. mycoides JCVI-syn1.0 genoma si è basata
sul estremamente preciso finito sequenze del genoma di due
ceppi di laboratorio di M. mycoides sottospecie GM12 Capri (8,
9) (11). Uno era il donatore del genoma usato da al Lartigue et al.
[GenBank adesione CP001621] (10). L’altro era un ceppo
creato da trapianto del genoma che era stata clonata
e costruito nel lievito, YCpMmyc1.1-.typeIIIres,
[GenBank adesione CP001668] (8). Questo progetto è stato
criticamente dipende dalla precisione di queste sequenze.
Anche se riteniamo che sia finito M. mycoides genoma
sequenze sono affidabili, ci sono 95 siti in cui differiscono.
Abbiamo iniziato a progettare il genoma sintetico prima che sia
sequenze erano finiti. Di conseguenza, la maggior parte delle cassette
sono stati progettati e sintetizzati basato sulla CP001621
sequenza (11). Quando è stato finito, abbiamo deciso di utilizzare la
sequenza del genoma trapiantato con successo da lieviti
(CP001668) come riferimento il nostro progetto (ad eccezione che abbiamo mantenuto la
typeIIIres gene intatto). Tutte le differenze che apparivano
biologicamente significative tra CP001668 e in precedenza
cassette di sintesi sono stati corretti in modo che corrisponda esattamente (11).
le differenze di sequenza tra le nostre cassette di sintesi e
CP001668 che si sono verificati in 19 siti apparso innocuo, e così
non sono stati corretti. Questi forniscono 19 polimorfica
differenze tra il nostro genoma sintetico (JCVI-syn1.0) e
la naturale (non sintetici) genoma (YCpMmyc1.1) che abbiamo
hanno clonato nel lievito e utilizzare come standard per genoma
trapianto da lievito (8). Per differenziare ulteriormente
tra il genoma sintetico e quello naturale, quattro
sequenze filigrana (fig. S1) sono stati progettati per sostituire una
o cassette di più nelle regioni dimostrato sperimentalmente
(Filigrane 1 [1246 bp] e 2 [1081 BP]) o la prevedibile
(Filigrane 3 [1.109 bp] e 4 [1.222 bp]) non interferire
con la vitalità cellulare. Queste sequenze filigrana codificare unico
identificatori, pur limitando la loro traduzione in peptidi. Tavolo
S1 elenca le differenze tra il genoma sintetico e questo
standard naturale. Figura S2 mostra una mappa del M. mycoides
JCVI-syn1.0 genoma. Casette e assemblaggio intermedio
confini, filigrane, delezioni, inserzioni, e geni
il M. mycoides JCVI syn1.0 sono mostrati in fig. S2, e il
sequenza del clone micoplasma trapiantato
sMmYCp235-1 è stato presentato alla GenBank (adesione #
CP002027).
pSynthetic strategia di assemblaggio del genoma
Le cassette sono state generalmente progettate 1.080 bp a 80 bp
sovrappone a cassette adiacenti (11). Essi sono stati tutti prodotti da
assemblaggio di oligonucleotidi sintetizzati chimicamente da Blue
Heron, Bothell, Washington. Ogni cassetta è stata individualmente
sintetizzato e sequenza verificato dal costruttore. A
aiuto nel processo di costruzione, cassette di DNA e l’assemblaggio
intermedi sono stati progettati per contenere Non io restrizione siti
a loro termini, e ricombinati alla presenza del vettore
elementi per consentire la crescita e la selezione in lievito (7) (11).
pA strategia gerarchico è stato progettato per assemblare il
genoma in 3 fasi per la trasformazione e omologhi
ricombinazione in lievito 1.078 cassette da un kb (Fig. 1)
(12, 13).
Assemblea degli intermedi sintetici di 10 kb. Nel primo
fase, cassette e un vettore sono stati ricombinati in lievito e
trasferiti a E. coli (11). DNA del plasmide è stato quindi isolato
da singoli cloni di E. coli e digerito allo schermo per le cellule
contenente un vettore con un inserto montato 10-kb. Uno
successo di montaggio di 10 kb è rappresentato (Fig. 2a). In
generale, almeno un frammento di 10 kb potrebbe essere assemblata
ottenuti dallo screening 10 cloni di lievito. Tuttavia, il tasso di
successo varia dal 10-100%. Tutte le prima fase
intermedi sono stati sequenziati. Diciannove su 111
assemblee conteneva errori. Alternate cloni sono stati selezionati,
Sequenza-verificati, e si è trasferito al prossima assemblea fase
(11).
Assemblea degli intermedi sintetici da 100 kb. Il pool
10-KB assemblee e dei loro vettori di clonazione sono stati rispettivamente
trasformato in lievito come sopra per la produzione di montaggio 100 kb
intermedie (11). I nostri risultati indicano che i prodotti
non può essere mantenuto stabilmente in E. coli DNA ricombinato in modo
doveva essere estratto dal lievito. Multiplex PCR è stata effettuata
su cloni lieviti selezionati (fig. S3 e S2 tabella). Perché ogni
10 KB di assemblaggio intermedio era rappresentata da una coppia di primer
in questa analisi, la presenza di tutti ampliconi suggerirebbe
un concentrato di 100 kb intermedi. In generale, il 25% o più
dei cloni selezionati conteneva tutti gli ampliconi
previsto per un montaggio completo. Uno di questi cloni è stato
selezionate per ulteriori controlli. Circolare plasmide DNA è stato
estratti e imprese su un gel di agarosio accanto ad un supercoiled
marker. Il successo assemblee di seconda fase con il vettore
sequenza sono circa 105 kb di lunghezza (fig. 2b). Quando
tutti ampliconi sono stati prodotti PCR multiplex, un
assemblea di seconda fase intermedia della dimensione corretta era
solitamente prodotte. In alcuni casi, tuttavia, piccole delezioni
si è verificato. In altri casi, più frammenti di 10 kb sono stati
assemblati, che ha prodotto un più grande assemblea di seconda fase
intermedi. Fortunatamente, queste differenze potrebbero essere facilmente
?
rilevati su un gel di agarosio prima completa del genoma
montaggio.
Completare il montaggio del genoma. In preparazione per la finale
fase di montaggio, è stato necessario isolare microgrammi
quantitativi di ciascuna delle assemblee 11 secondo stadio (11). Come
segnalati (14), plasmidi circolare le dimensioni della nostra seconda fase
assemblee poteva essere isolato dal sferoplasti lievito dopo un
alcalino-lisi procedura. Per purificare ulteriormente le 11 assemblea
intermedi, sono stati trattati con exonuclease e passato
attraverso una colonna a scambio anionico. Una piccola frazione del
totale di DNA del plasmide (1/100th) è stato digerito con Not I e
analizzati mediante elettroforesi su gel a campo-inversione (FIGE) (Fig.
2c). Questo metodo produce ~ 1 mg di ogni assemblea per 400
lievito madre ml (~ 1011 celle).
Il metodo di cui sopra non rimuove completamente tutti i
lievito DNA cromosomico lineare, che abbiamo trovato possa
ridurre notevolmente la trasformazione del lievito e il montaggio
efficienza. Per arricchire ulteriormente per l’assemblaggio undici circolare
intermedi, ~ 200 campioni ng di ogni assemblea sono stati
riunite e mescolate con agarosio fuso. Come l’agarosio
solidifica, il filo attraverso le fibre e topologicamente “trappola”
DNA circolare (15). DNA non catturato lineare può essere
elettroforesi su agarosio la spina, arricchendo così la
intrappolate molecole circolari. L’assemblea undici circolare
intermedi sono stati digeriti con Non io in modo che gli inserti
potrebbe essere rilasciato. In seguito, frammenti furono
estratta dalla presa di agarosio, analizzata da FIGE (Fig. 2d),
e trasformata in sferoplasti lievito (11). In questa terza e
fase finale di montaggio, una sequenza di vettore aggiuntivo non è stato
richiesto, poiché il lievito clonazione elementi sono stati già
presenti in assemblea 811-900.
Per schermo per un genoma completo, PCR multiplex è stata
effettuato con 11 coppie di primer, progettato per occupare ciascuno dei
undici svincoli di montaggio di 100 kb (S3 tabella). Di 48 colonie
schermato, DNA estratto da un clone (sMmYCp235)
prodotte tutte le 11 ampliconi. PCR di tipo selvatico (WT)
controllo positivo (YCpMmyc1.1) ha prodotto un
insieme indistinguibile di 11 ampliconi (Fig. 3a). Per ulteriori
dimostrare l’assemblaggio completo di un sintetico M.
mycoides genoma, il DNA intatto è stato isolato da lievito in
spine agarosio e sottoposto a due analisi di restrizione; Asc I
BssH e II (11). Dato che questi siti di restrizione sono presenti in
tre delle quattro sequenze di filigrana, questa scelta di
digestione produce modelli di restrizione che si distinguono dai
il naturale M. mycoides genoma (figg. 1 e 3b). Il
sMmYCp235 clone prodotto il profilo di restrizione attesi
per un genoma sintetico completamente montato (Fig. 3c).
pSynthetic trapianto di genoma
spine agarosio Ulteriori utilizzati per l’analisi di gel sopra (Fig.
3c) sono stati utilizzati anche in esperimenti di trapianto del genoma
(11). Intatto genoma sintetico signor mycoides dal
sMmYCp235 clone lievito sono stati trapiantati in restrictionminus
M. capricolum cellule riceventi, come descritto (8). Risultati
sono stati segnati da selezionare per la crescita di colonie blu sulla SP4
supporto contenente tetraciclina e X-gal a 37 ° C. Genomi
isolati da questo clone lievito ottenuto tetracyclineresistant 5-15
colonie blu per agarosio spina. Questo è stato comparabile
al controllo YCpMmyc1.1. Il recupero delle colonie in tutti i
esperimenti di trapianto è stato dipendente dalla presenza di
entrambe le celle M. destinatario capricolum e un M. mycoides
genoma.
Semi-sintetico di assemblaggio e il trapianto di genoma
Per facilitare la verifica della funzionalità di ogni 100 kb sintetico
genomi segmento, semi-sintetico sono state costruite e
trapiantati. Miscelando pezzi naturali con quelli sintetici,
la costruzione di successo di ogni assemblea sintetico da 100 kb
hanno potuto essere verificate, senza dover sequenza di queste
intermedi. Abbiamo clonato 11 sovrapposizione naturale da 100 kb
assemblee in lievito utilizzando un metodo precedentemente descritto
(16). In 11 reazioni parallele, cellule di lievito sono stati co-trasformato
con M. mycoides frammentato genomic DNA (YCpMmyc
1.1) che in media ~ 100 kb di lunghezza e una PCR-amplificato
vettore progettati per sovrapporsi alle estremità degli inserti di 100 kb. A
mantenere le sovrapposizioni appropriate affinché naturali e sintetici
frammenti possono essere ricombinati, i vettori PCR-amplificato
sono stati prodotti tramite iniettori con le sovrapposizioni di 40 bp stesso usato
per clonare le assemblee di 100 KB di sintesi. Il semi-sintetico
genomi che sono stati costruiti contenuta tra due e
dieci degli undici sottoinsiemi di 100 kb di sintesi (tabella 1).
La produzione di colonie vitali prodotti dopo
trapianto, ionfirmed che la frazione di sintesi di ogni
genoma non contiene mutazioni letali. Solo uno dei 100 –
sottoinsiemi kb, 811-900, non era praticabile.
Inizialmente, un messaggio di errore contenente 811-820 clone è stato utilizzato per
produrre un genoma sintetico che non il trapianto. Questo è stato
atteso poiché l’errore è stato un unico cancellazione coppia di basi che
crea un frameshift in dnaA, un gene essenziale per
replicazione dei cromosomi. Eravamo già a conoscenza di
questa mutazione. Utilizzando una costruzione semi-sintetico del genoma
strategia, siamo stati in grado di individuare 811-900 come origine per
fallito esperimenti di trapianto di sintesi. Così, abbiamo iniziato
di rimontare un errore privo di 811-900 assemblea, che è stato
utilizzati per produrre lo sforzo sMmYCp235 lievito. Il dnaAmutated
genoma differisce solo per un nucleotide del
genoma sintetico in sMmYCp235. Questo genoma servito da
controllo negativo nei nostri esperimenti di trapianto. Il dnaA
mutazione è stata riparata anche a livello di 811-900 da genoma
ingegneria nel lievito (17). Un assembly è stato riparato 811-900
utilizzato in una fase finale di assemblaggio per produrre un clone di lievito con un
riparazione del genoma. Questo clone è chiamato lievito sMmYCP142
e potrebbero essere trapiantati. Un elenco completo dei genomi che
?
sono stati assemblati da 11 pezzi e con successo
trapiantato è previsto nella tabella 1.
Caratterizzazione dei trapianti di sintesi
Per distinguere rapidamente i trapianti di sintesi provenienti da M.
capricolum o naturale mycoides M., due analisi sono state
eseguita. In primo luogo, quattro coppie di primer che sono specifici per ciascuna delle
i quattro filigrane sono stati progettati in modo tale che essi producono
ampliconi quattro in una singola reazione di PCR multiplex (tabella S4).
Tutti e quattro gli ampliconi sono stati prodotti da trapianto generata
da sMmYCp235, ma non YCpMmyc1.1 (Fig. 4a). In secondo luogo,
l’analisi gel con Asc I e II BssH, descritto in precedenza (Fig.
3D), è stata effettuata. Il pattern di restrizione ottenuto è stato
coerente con un trapianto di prodotto da un sintetico M.
mycoides genoma (Fig. 4b).
Un trapianto singolo provenienti dal sMmYCp235
genoma sintetico è stato sequenziato. Ci riferiamo a questo ceppo di M.
mycoides JCVI-syn1.0. La sequenza ha riscontrato l’intesa
design con l’eccezione dei polimorfismi noti, 8
nuovi polimorfismi di singoli nucleotidi, un trasposone E. coli
inserimento, e di una duplicazione di 85 bp (tabella S1). I trasposoni
inserimento corrisponde esattamente la dimensione e la sequenza di IS1, un
trasposone in E. coli. E ‘probabile che IS1 infetto il 10-KB
sub-assemblaggio seguito del suo trasferimento in E. coli. L’inserto IS1
è fiancheggiata da ripetizioni dirette di M. mycoides successione
suggerendo che è stato inserito da un meccanismo di recepimento.
La duplicazione di 85 bp è il risultato di un non-omologa end
evento che unisce, non è stata rilevata nella nostra sequenza
analisi in fase di 10 kb. Questi due inserimenti disturbare due
geni che sono evidentemente non essenziali. Non abbiamo trovato alcuna
le sequenze del genoma sintetico che potrebbe essere identificata come
appartenenti a capricolum M.. Questo indica che c’è stato un
la sostituzione completa del genome capricolum M. dal nostro
genoma sintetico durante il processo di trapianto.
Le celle con solo il genoma sintetico sono auto
replica e capace di una crescita logaritmica. Scansione e
microscopio elettronico a trasmissione (EM) di M. mycoides
JCVI-syn1.0 celle mostrano piccole celle ovoidale circondato da
membrane citoplasmatica (Fig. 5c-5F). Analisi di proteomica
M. mycoides JCVI-syn1.0 e il WT di controllo
(YCpMmyc1.1) di due-dimensionale elettroforesi su gel
rivelato pressoché identico pattern di macchie proteine (fig. S4)
e questi erano chiaramente diversi da quelli precedentemente
riportati per capricolum M. (10). Quattordici i geni sono soppresse
o interrotto in M. mycoides JCVI-syn1.0 genoma,
Tuttavia, il tasso di comparsa di colonie su piastre di agar e
la morfologia delle colonie sono simili (confronta fig. 5a e b).
Abbiamo fatto osservare differenze nei tassi di crescita in un
colore fasciatoio test, con la JCVI-syn1.0 trapianti
crescita leggermente più veloce rispetto al controllo MmcyYCp1.1 ceppo
(Fig. S6).
Discussione
Nel 1995, lo standard di qualità per il sequenziamento è stato considerato
da un errore su 10.000 bp e il sequenziamento di un
microbica mesi genoma richiesto. Oggi, la precisione è
decisamente più elevati. copertura del genoma di 30-50X non è
insolito e sequenziamento richiede solo pochi giorni. Tuttavia,
ottenere un genoma privo di errori che potrebbero essere trapiantate in
destinatario di una cella per creare una nuova cella controllata solo dalla
genoma sintetico è stato complicato e ha richiesto molte qualità
controllo passi. Il nostro successo è stato sventato per molte settimane da un
singola coppia di soppressione di base per le dnaA gene essenziale. Uno
base sbagliata su oltre un milione in un gene essenziale
rese inattivo il genoma, mentre i principali inserimenti genoma
e le eliminazioni nelle parti non essenziali del genoma non ha avuto
conseguenze osservabili redditività. La dimostrazione che la nostra
genoma sintetico dà luogo a trapianto con la
caratteristiche delle cellule M. mycoides implica che il DNA
sequenza su cui si basa è abbastanza accurati da specificare
una cellula vivente, con le proprietà appropriate.
Il nostro approccio sintetico genomica sta in netto contrasto con
una varietà di approcci diversi al genoma di ingegneria che
modificare genomi naturali con l’introduzione di inserimenti multipli,
sostituzioni o eliminazioni (18-22). Questo lavoro fornisce un
prova di principio per la produzione di celle sulla base genoma
sequenze progettate nel computer. sequenziamento del DNA di un
genoma cellulare consente la memorizzazione delle istruzioni genetiche per
la vita come un file digitale. Il genoma sintetico descritto in questo
carta è solo modifiche limitate dalla natura
che si verificano M. mycoides genoma. Tuttavia, l’approccio che abbiamo
hanno messo a punto dovrebbero essere applicabili alla sintesi e
trapianto di genomi romanzo più come design genoma
avanza (23).
Ci riferiamo a una tale cella controllata da un genoma assemblato
da sintesi chimica pezzi di DNA come un “sintetico
cella “, anche se il citoplasma della cellula ricevente non è
sintetico. effetti fenotipici del citoplasma destinatario sono
diluito con un fatturato di proteine e le cellule che trasportano solo il
trapiantati genoma replicare. A seguito di trapianto e
replica su un piatto a formare una colonia (> 30 divisioni o> 109
diluizione volte), la progenie non conterrà molecole di proteina
che erano presenti nella cella originale destinatario (10, 24). Questo
è stato precedentemente dimostrato quando abbiamo descritto genoma
trapianto (10). Le proprietà delle cellule controllata da
il genoma assemblato dovrebbero essere gli stessi, come se il
cellula intera era stata prodotta sinteticamente (il DNA
software costruisce il proprio hardware).
Il tp capacità di produrre cellule sintetiche lo rende essenziale
per i ricercatori rendere DNA sintetico costrutti e delle cellule
chiaramente filigrana il loro lavoro per distinguerla dalla natura
che si verificano sul DNA e delle cellule. Abbiamo filigrana il sintetico
cromosoma in questo e il nostro precedente studio (7).
?
Se i metodi qui descritti possono essere generalizzate, design,
sintesi, assemblaggio, e il trapianto di sintesi
cromosomi non sarà più un ostacolo al progresso della
biologia sintetica. Ci aspettiamo che il costo della sintesi del DNA
seguirà quello che è successo con il sequenziamento del DNA e
continuano a diminuire in modo esponenziale. Abbassare i costi di sintesi
combinato con l’automazione consentirà di massima per le applicazioni
genomica sintetica.
Siamo stati la guida del dibattito etico in materia
vita sintetica dalle prime fasi di questo lavoro (25, 26). Come
applicazioni di genomica sintetica espandersi, possiamo anticipare che questa
il lavoro continuerà a sollevare questioni filosofiche che hanno
ampio implicazioni sociali ed etiche. Incoraggiamo l’
discorso continuato.
Riferimenti e note
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23. Collins Khalil, JJ, Nat Genet Ap 11, 367 (maggio).
24. Una cellula micoplasma, con una massa di cellule di circa 10-13 g,
contiene meno di 106 molecole di proteina. (Se
contiene il 20% di proteine si tratta di 2 x 10-14 g di proteine per cella. A
un peso molecolare di 120 dalton per residui di aminoacidi
ogni cella contiene (2 x 10-14) / 120 = 1.7 x 10-16 moli di
peptide residui. Questo è di 1,7 x 10-16 x 6 x 1023 = 1 x 108
residui per cella. Se la dimensione media di una proteina è di 300
residui allora una cella contiene circa 3 x 105 proteine
molecole.) Dopo 20 divisioni cellulari il numero di discendenti
supera il numero totale di molecole proteiche presenti nel
la cellula ricevente. Così, dopo il trapianto e
replica a formare una colonia su un piatto, la maggior parte delle cellule si
non contengono molecole proteiche che erano presenti nel
originale cellula ricevente.
25. MK Cho, D. Magnus, Caplan AL, D. McGee, Scienza
286 del 2087 (10 Dicembre 1999).
26. MS Garfinkel, D. Endy, Epstein GE, Friedman RM.
(2007).
27. DG Gibson et al. Metodi Nat 6, 343 (maggio 2009).
28. Ringraziamo Synthetic Genomics, Inc. per il generoso finanziamento
di questo lavoro. Ringraziamo J. B. Hostetler, D. Radune, N. B.
Fedorova, Kim MD, BJ Szczypinski, Singh IK, JR
Miller, S. Kaushal, Friedman RM, e J. Mulligan per
il loro contributo a questo lavoro. Electron micrografie
sono stati gentilmente forniti da T. Deerinck e M. Ellisman
del Centro nazionale per la microscopia e Imaging
Ricerca presso l’Università della California a San Diego.
J.C.V. è Chief Executive Officer e Co-direttore scientifico
Officer di SGI. H.O.S. è Co-Direttore Scientifico e
il Consiglio di Amministrazione di SGI. C.A.H. è presidente della
SGI il Comitato Scientifico. Tutti e tre questi
autori e JCVI detenere stock SGI. JCVI ha depositato brevetti
applicazioni su alcune delle tecniche descritte nel presente
carta.
Materiale di supporto online
Materiali e Metodi
Fichi. S1 a S6
Tavoli da S1 a S7
Riferimenti
9 aprile 2010; accettato 13 Maggio 2010
Pubblicato online il 20 maggio 2010; 10.1126/science.1190719
Includere queste informazioni quando citando questo articolo.
Fig. 1. Il montaggio di una sintetica M. mycoides genoma in
lievito. Un genoma sintetico M. mycoides è stato assemblato da
1.078 cassette di DNA sovrapposti in tre fasi. Nel primo
passo, 1.080-bp cassette (frecce arancioni), prodotto da
sovrapposizione oligonucleotidi sintetici, sono stati ricombinati in
confezioni da 10 pezzi per la produzione di assemblaggi 109 ~ 10 KB
(Frecce blu). Questi sono stati poi ricombinati in confezioni da 10 a
produrre undici assemblee ~ 100 KB (frecce verdi). Nel
fase finale di montaggio, questi frammenti undici
ricombinato nel genoma completo (cerchio rosso). Con l’
?
tranne il 2 costrutti che sono stati enzimaticamente pieced
insieme in vitro (27) (frecce bianche), le assemblee sono state effettuate
da in vivo ricombinazione omologa in lievito. Grande
variazioni rispetto al genoma naturale sono mostrati in giallo
cerchi. Questi includono 4 Regioni filigranata (WM1-WM4),
una regione da 4 KB che è stato volutamente cancellato (94 quinquies), e
elementi per la crescita nel lievito e il trapianto di genoma. In
Inoltre, vi sono 20 località con nucleotide
polimorfismi (asterischi). Coordinate del genoma sono
rispetto al primo nucleotide del M. mycoides naturale
sequenza. La sequenza è progettato 1.077.947 bp. Il
I luoghi della Asc e BssH siti di restrizione II sono mostrate.
Cassette 1 e 800-810 sono stati inutili e rimossi dal
la strategia di assemblaggio (11). Cassetta 2 sovrapposizioni cassette 1104
799 e cassette sovrapposizioni cassetta 811.
Fig. 2. L’analisi degli intermedi di montaggio. (A) Non io e
SBF faccio doppio digestione analisi di restrizione di montaggio 341 –
350 purificato da E. coli. Questi enzimi di restrizione di rilascio
i frammenti vettore (5,5 kb e 3,4 kb) dal-10 kb
Inserisci. Inserisci il DNA è stato separato dal DNA di vettore su un
0,8% E-gel (Invitrogen). M indica la scala del DNA di 1 kb
(Biolabs New England, NEB). (B) Analisi del montaggio 501 –
600 purificato da lievito. I cerchi a 105 kb (100 kb inserire
più 5-kb vettore) sono stati separati dal lievito lineare
DNA cromosomico di un 1% gel mediante l’applicazione di 4,5
V / cm per 3 ore. S indica il BAC-Tracker supercoiled
DNA ladder (Epicentre). (C) Non ho restrizione digestione
analisi delle undici assemblee ~ 100 kb purificato da
lievito. Questi frammenti di DNA sono stati analizzati da FIGE su un 1%
gel di agarosio. Le dimensioni inserto previsto per ogni assemblea è
indicato. . indica la scala lambda (NEB). (D) Analisi
delle 11 assemblee riunite in (c) a seguito
cattura topologiche del DNA circolare e non ho la digestione.
Un quarantesimo del DNA usato per trasformare il lievito è
rappresentati.
Fig. 3. Caratterizzazione del genoma sintetico isolato dal
lievito. (A) cloni di lievito contenente una completamente assemblato
genoma sintetici sono stati esaminati da PCR multiplex con un
primer set che produce 11 ampliconi, uno in ciascuna delle 11
montaggio dei raccordi. Lievito clone sMmYCp235 (235)
prodotto i 11 prodotti di PCR attesi per una completa
assemblaggio del genoma. Per confronto, il genoma naturale
estratto dal lievito (WT) è stato anche analizzato. Prodotti di PCR
sono stati separati su un 2% E-gel (Invitrogen). L indica il
100-bp ladder (NEB). (B) Le dimensioni del previsto Asc I e
BssH frammenti di restrizione II per naturale (WT) e sintetiche
(Syn235) M. mycoides genomi. (C) Naturale (WT) e
sintetici (235) M. mycoides genomi sono stati isolati da
lievito in spine agarosio. Inoltre, il DNA è stato purificato da
il ceppo ospite da solo (H). tappi di agarosio sono stati digeriti con
Asc I o II BssH e frammenti sono stati separati da serrate
omogenea campo elettrico (Chef) elettroforesi su gel.
Frammenti di restrizione corrispondenti alle dimensioni corrette sono
indicato dai numeri frammento mostrato in (b).
Fig. 4. Caratterizzazione dei trapianti. (A) Trapianti
contenente un genoma sintetico sono stati esaminati da multiplex
PCR con un set di primer che produce 4 ampliconi, uno interno
a ciascuno dei quattro filigrane. Un trapianto (syn1.0)
provenienti da lievito clone sMmYCp235 è stato analizzato
accanto ad una naturale, genoma non sintetici (WT) trapiantati
di lievito. Il trapianto del genoma sintetico contenente
prodotto i 4 prodotti PCR mentre il genoma WT ha
non producono alcun. I prodotti di PCR sono stati separati su un 2% E-gel
(Invitrogen). (B) Naturale (WT) e sintetiche (syn1.0) M.
mycoides genomi sono stati isolati da M. mycoides
trapianti di spine agarosio. spine agarosio sono stati digeriti
con Asc I o II BssH e frammenti sono stati separati da CHEF
elettroforesi su gel. Frammenti di restrizione corrispondenti a
le dimensioni corrette sono indicate con i numeri frammento
mostrato in fig. 3 ter.
Fig. 5. Immagini di M. mycoides JCVI-syn1.0 e WT M.
mycoides. Per confrontare il fenotipo del JCVI-syn1.0 e
non YCP ceppi WT, abbiamo esaminato la morfologia colonia
placcatura cellule su piastre contenenti agar SP4 X-gal. Tre giorni
dopo la placcatura, il syn1.0 colonie JCVI sono blu perché il
cellule contengono il gene lacZ ed esprimere la beta-galattosidasi,
che converte l’X-gal di un composto blu (a). Il WT
le cellule non contengono lacZ e rimangono bianche (b). Entrambi i cellulari
i tipi hanno la caratteristica uovo fritto colonia morfologia del
maggior parte dei micoplasmi. EMs sono state fatte delle JCVI-syn1.0
isolare utilizzando due metodi. (C) per la scansione EM, i campioni
sono stati post-fissati in tetrossido di osmio, disidratata e critica
punto secco con la CO2, e visualizzati utilizzando un SU6600 Hitachi
SEM del 2,0 keV. (D) EMS trasmissione Negativamente macchiato di
cellule in divisione con 1% di acetato di uranile in carbonio puro
substrato visualizzato per mezzo di JEOL 1200EX CTEM a 80 keV.
Per esaminare la morfologia delle cellule, abbiamo confrontato di acetato di uranile
EM macchiato di M. mycoides JCVI-syn1.0 cellule (e) con EMS
di cellule WT effettuati nel 2006 che sono stati colorati con ammonio
molibdato (f). Entrambi i tipi di cellule mostrano la stessa ovoidale
morfologia e l’aspetto generale. EM sono stati forniti da
Tom Deerinck e Ellisman Mark of the National Center for
Microscopia e Imaging Research presso l’Università di
California a San Diego.
?
Tabella 1. Genomi che sono stati assemblati da 11 pezzi e trapiantate con successo. Assemblea 200-100 = 1, il montaggio 101 –
200 = 2, assemblea 201-300 = 3, 301-400 = 4 montaggio, assemblaggio 401-500 = 5, assemblea 501-600 = 6, il montaggio 601-700 = 7,
montaggio 701-799 = 8, il montaggio 811-900 = 9, assemblea 901-1.000 = 10, assemblea 1001-1104 = 11. WM indica filigranata
montaggio.
Genoma Assemblea
Sintetico Frammenti
Naturale Frammenti
Ricostituita genoma naturale
Nessuno
1-11
2 / 11 del genoma semi-sintetico con 1 filigrana
5WM, 10
1-4, 6-9, 11
8 / 11 genoma semi-sintetico senza watermark
1-4, 6-8, 11
5, 9, 10
9 / 11 genoma semi-sintetico senza watermark
1-4, 6-8, 10-11
5, 9
9 / 11 genoma semi-sintetico di 3 filigrane
1, 2WM, 3WM, 4, 6, 7WM, 8, 10-11
5, 9
10/11 genoma semi-sintetico di 3 filigrane
1, 2WM, 3WM, 4, 5WM, 6, 7WM, 8, 10-11
9
11/11 genoma sintetico, 811-820 correzione del dnaA
1, 2WM, 3WM, 4, 5WM, 6, 7WM, 8, 9-11
Nessuno
11/11 genoma sintetico, 811-900 correzione del dnaA
1, 2WM, 3WM, 4, 5WM, 6, 7WM, 8, 9-11
Nessuno
?
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©2010

Creazione di una cellula batterica controllata da una sintesi chimica del Genoma
Daniel G. Gibson, 1 Giovanni I. di vetro, 1 Carole Lartigue, 1 Vladimir N. Noskov, 1 Chuang Ray-Yuan, 1 Mikkel A. Algire, 1 Benders Gwynedd A., Michael G. Montecchi, 1 Ma Li, 1 Monzia M. Moodie, 1 Merryman Chuck, 1 2 Sanjay Vashee, 1 Krishnakumar Radha, 1 Nacyra Assad-Garcia, 1 Cynthia Andrews-Pfannkoch, 1 Evgeniya A. Denisova, 1 Lei giovane, 1 Qi Zhi-Qing, 1 H. Thomas Segall-Shapiro, 1 Christopher H. Calvey, 1 Prashanth P. Parmar, 1 Clyde A. Hutchison III, 2 Hamilton O. Smith, 2 J. Craig Venter1, 2 *
J. Craig Venter 1Il Institute, 9.704 Drive Medical Center, Rockville, MD 20850, USA. J. Craig Venter 2Il Institute, 10.355 Science Center Drive, San Diego, CA 92121, USA.
* A chi la corrispondenza deve essere affrontato. E-mail: jcventer@jcvi.org
Segnaliamo la progettazione, la sintesi e l’assemblaggio del 1,08- MBP Mycoplasma mycoides JCVI-syn1.0 genoma di partenza dalle informazioni digitalizzate sequenza del genoma e la sua trapianto in un destinatario Mycoplasma capricolum cella per creare nuovi Mycoplasma mycoides cellule che sono controllata solo dal cromosoma sintetico. L’unico DNA nelle cellule è il progettato sequenza di DNA sintetico, tra cui “filigrana” sequenze e altre iniziative volte delezioni e polimorfismi del gene e le mutazioni acquisite durante il processo di costruzione. Le nuove cellule sono attesi proprietà fenotipiche e sono in grado di continua auto-replicazione.
Nel 1977, Sanger e colleghi hanno determinato il completo codice genetico del fago fX174 (1), il genoma DNA primo ad essere completamente sequenziato. Diciotto anni dopo, nel 1995, il nostro team è stato in grado di leggere il primo codice genetico completo di un selfreplicating batterio Haemophilus influenzae (2). Lettura il codice genetico di una vasta gamma di specie è aumentata in modo esponenziale da questi primi studi. La nostra capacità di rapido digitalizzazione delle informazioni genomiche è aumentato di oltre il otto ordini di grandezza negli ultimi 25 anni (3). Gli sforzi per comprendere tutte queste nuove informazioni genomiche hanno generato numerosi nuovi paradigmi computazionali e sperimentali, tuttavia la nostra conoscenza genomica ancora molto limitata. Nessun singolo sistema cellulare ha tutti i suoi geni intesa in termini di il loro ruolo biologico. Anche in semplici cellule batteriche, effettuare le cromosomi contengono tutto il repertorio genetico? Se è così, può un sistema completo genetico essere riprodotto dalle chimica di sintesi, partendo con solo la sequenza del DNA digitalizzato contenute in un computer?
Il nostro interesse nella sintesi di molecole di DNA di grandi dimensioni e cromosomi è cresciuto fuori dei nostri sforzi negli ultimi 15 anni per costruire una cella minimale che contiene solo i geni essenziali. Questo lavoro è stato inaugurato nel 1995 quando abbiamo sequenziato il genoma di Mycoplasma genitalium, un batterio con la più piccolo complemento dei geni di qualsiasi organismo noto capace di una crescita indipendente in laboratorio. Oltre 100 dei 485 geni che codificano le proteine di M. genitalium sono dispensabile quando interrotto uno-a-un-tempo (4-6).
Abbiamo sviluppato una strategia per l’assemblaggio di pezzi di dimensioni virale per la produzione di molecole di DNA di grandi dimensioni che ci ha permesso di assemblare genoma sintetico M. genitalium in quattro fasi, dalla cassette del DNA per sintesi chimica media di circa 6 kb nel formato. Ciò è stato realizzato attraverso una combinazione di enzimatici metodi in vitro e in vivo su ricombinazione Saccharomyces cerevisiae. L’intero genoma sintetico (582.970 bp) è stabilmente cresciuto come un lievito centromerica plasmide (YCP) (7).
Molti ostacoli sono stati superati nel trapianto e esprimendo un cromosoma di sintesi chimica, in un cellula ricevente. Avevamo bisogno di migliorare i metodi per l’estrazione cromosomi intatti dal lievito. Abbiamo anche bisogno di imparare di trapiantare questi genomi in una cellula ricevente batterica stabilire una cella controllata solo da un genoma sintetico. A causa di il fatto che M. genitalium ha un tasso di crescita estremamente lenta, ci siamo rivolti a due specie di micoplasma più veloce crescita, M. mycoides sottospecie Capri (GM12) come donatore, e M. capricolum sottospecie capricolum (CK) come destinatario.
Per stabilire le condizioni e le procedure per il trapianto fuori sintetico genoma del lievito, abbiamo sviluppato metodi per la clonazione intero cromosomi batterici come centromerica plasmidi di lievito di birra, tra cui un nativo M. mycoides genoma (8, 9). Tuttavia, i tentativi iniziali di estrarre il M. mycoides genoma di lievito e trapiantarla in capricolum M. fallito. Abbiamo scoperto che il donatore e ricevente micoplasmi condividono un sistema comune di restrizione. Il donatore genoma è stato metilato nelle cellule native M. mycoides e è quindi protetto contro le restrizioni durante la trapianto da un donatore di cellule native (10). Tuttavia, il genomi batterici cresciuti in lievito sono metilato e quindi sono non protetti dal sistema di restrizione unico del cellula ricevente. Siamo stati in grado di superare questa limitazione
? barriera metilante il DNA donatore con purificato metilasi o greggio M. mycoides o estratti capricolum M., o semplicemente interrompere sistema di restrizione della cellula ricevente (8).
Ora abbiamo unito tutte le nostre precedentemente stabilito procedure e la relazione di sintesi, il montaggio, la clonazione, e trapianto con successo il 1,08-MBP M. mycoides JCVI-syn1.0 genoma, per creare una nuova cella controllata da questa genoma sintetico.

Risultati
Sintetico design genoma
Struttura della M. mycoides JCVI-syn1.0 genoma si è basata sul estremamente preciso finito sequenze del genoma di due ceppi di laboratorio di M. mycoides sottospecie GM12 Capri (8, 9) (11). Uno era il donatore del genoma usato da al Lartigue et al. [GenBank adesione CP001621] (10). L’altro era un ceppo creato da trapianto del genoma che era stata clonata e costruito nel lievito, YCpMmyc1.1-.typeIIIres, [GenBank adesione CP001668] (8). Questo progetto è stato criticamente dipende dalla precisione di queste sequenze. Anche se riteniamo che sia finito M. mycoides genoma sequenze sono affidabili, ci sono 95 siti in cui differiscono. Abbiamo iniziato a progettare il genoma sintetico prima che sia sequenze erano finiti. Di conseguenza, la maggior parte delle cassette sono stati progettati e sintetizzati basato sulla CP001621 sequenza (11). Quando è stato finito, abbiamo deciso di utilizzare la sequenza del genoma trapiantato con successo da lieviti (CP001668) come riferimento il nostro progetto (ad eccezione che abbiamo mantenuto la typeIIIres gene intatto). Tutte le differenze che apparivano biologicamente significative tra CP001668 e in precedenza cassette di sintesi sono stati corretti in modo che corrisponda esattamente (11). le differenze di sequenza tra le nostre cassette di sintesi e CP001668 che si sono verificati in 19 siti apparso innocuo, e così non sono stati corretti. Questi forniscono 19 polimorfica differenze tra il nostro genoma sintetico (JCVI-syn1.0) e la naturale (non sintetici) genoma (YCpMmyc1.1) che abbiamo hanno clonato nel lievito e utilizzare come standard per genoma trapianto da lievito (8). Per differenziare ulteriormente tra il genoma sintetico e quello naturale, quattro sequenze filigrana (fig. S1) sono stati progettati per sostituire una o cassette di più nelle regioni dimostrato sperimentalmente (Filigrane 1 [1246 bp] e 2 [1081 BP]) o la prevedibile (Filigrane 3 [1.109 bp] e 4 [1.222 bp]) non interferire con la vitalità cellulare. Queste sequenze filigrana codificare unico identificatori, pur limitando la loro traduzione in peptidi. Tavolo S1 elenca le differenze tra il genoma sintetico e questo standard naturale. Figura S2 mostra una mappa del M. mycoides JCVI-syn1.0 genoma. Casette e assemblaggio intermedio confini, filigrane, delezioni, inserzioni, e geni il M. mycoides JCVI syn1.0 sono mostrati in fig. S2, e il sequenza del clone micoplasma trapiantato sMmYCp235-1 è stato presentato alla GenBank (adesione # CP002027).

pSynthetic strategia di assemblaggio del genoma
Le cassette sono state generalmente progettate 1.080 bp a 80 bp sovrappone a cassette adiacenti (11). Essi sono stati tutti prodotti da assemblaggio di oligonucleotidi sintetizzati chimicamente da Blue Heron, Bothell, Washington. Ogni cassetta è stata individualmente sintetizzato e sequenza verificato dal costruttore. A aiuto nel processo di costruzione, cassette di DNA e l’assemblaggio intermedi sono stati progettati per contenere Non io restrizione siti a loro termini, e ricombinati alla presenza del vettore elementi per consentire la crescita e la selezione in lievito (7) (11).
pA strategia gerarchico è stato progettato per assemblare il genoma in 3 fasi per la trasformazione e omologhi ricombinazione in lievito 1.078 cassette da un kb (Fig. 1) (12, 13).
Assemblea degli intermedi sintetici di 10 kb. Nel primo fase, cassette e un vettore sono stati ricombinati in lievito e trasferiti a E. coli (11). DNA del plasmide è stato quindi isolato da singoli cloni di E. coli e digerito allo schermo per le cellule contenente un vettore con un inserto montato 10-kb. Uno successo di montaggio di 10 kb è rappresentato (Fig. 2a). In generale, almeno un frammento di 10 kb potrebbe essere assemblata ottenuti dallo screening 10 cloni di lievito. Tuttavia, il tasso di successo varia dal 10-100%. Tutte le prima fase intermedi sono stati sequenziati. Diciannove su 111 assemblee conteneva errori. Alternate cloni sono stati selezionati, Sequenza-verificati, e si è trasferito al prossima assemblea fase (11).
Assemblea degli intermedi sintetici da 100 kb. Il pool 10-KB assemblee e dei loro vettori di clonazione sono stati rispettivamente trasformato in lievito come sopra per la produzione di montaggio 100 kb intermedie (11). I nostri risultati indicano che i prodotti non può essere mantenuto stabilmente in E. coli DNA ricombinato in modo doveva essere estratto dal lievito. Multiplex PCR è stata effettuata su cloni lieviti selezionati (fig. S3 e S2 tabella). Perché ogni 10 KB di assemblaggio intermedio era rappresentata da una coppia di primer in questa analisi, la presenza di tutti ampliconi suggerirebbe un concentrato di 100 kb intermedi. In generale, il 25% o più dei cloni selezionati conteneva tutti gli ampliconi previsto per un montaggio completo. Uno di questi cloni è stato selezionate per ulteriori controlli. Circolare plasmide DNA è stato estratti e imprese su un gel di agarosio accanto ad un supercoiled marker. Il successo assemblee di seconda fase con il vettore sequenza sono circa 105 kb di lunghezza (fig. 2b). Quando tutti ampliconi sono stati prodotti PCR multiplex, un assemblea di seconda fase intermedia della dimensione corretta era solitamente prodotte. In alcuni casi, tuttavia, piccole delezioni si è verificato. In altri casi, più frammenti di 10 kb sono stati assemblati, che ha prodotto un più grande assemblea di seconda fase intermedi. Fortunatamente, queste differenze potrebbero essere facilmente
? rilevati su un gel di agarosio prima completa del genoma montaggio.
Completare il montaggio del genoma. In preparazione per la finale fase di montaggio, è stato necessario isolare microgrammi quantitativi di ciascuna delle assemblee 11 secondo stadio (11). Come segnalati (14), plasmidi circolare le dimensioni della nostra seconda fase assemblee poteva essere isolato dal sferoplasti lievito dopo un alcalino-lisi procedura. Per purificare ulteriormente le 11 assemblea intermedi, sono stati trattati con exonuclease e passato attraverso una colonna a scambio anionico. Una piccola frazione del totale di DNA del plasmide (1/100th) è stato digerito con Not I e analizzati mediante elettroforesi su gel a campo-inversione (FIGE) (Fig. 2c). Questo metodo produce ~ 1 mg di ogni assemblea per 400 lievito madre ml (~ 1011 celle).
Il metodo di cui sopra non rimuove completamente tutti i lievito DNA cromosomico lineare, che abbiamo trovato possa ridurre notevolmente la trasformazione del lievito e il montaggio efficienza. Per arricchire ulteriormente per l’assemblaggio undici circolare intermedi, ~ 200 campioni ng di ogni assemblea sono stati riunite e mescolate con agarosio fuso. Come l’agarosio solidifica, il filo attraverso le fibre e topologicamente “trappola” DNA circolare (15). DNA non catturato lineare può essere elettroforesi su agarosio la spina, arricchendo così la intrappolate molecole circolari. L’assemblea undici circolare intermedi sono stati digeriti con Non io in modo che gli inserti potrebbe essere rilasciato. In seguito, frammenti furono estratta dalla presa di agarosio, analizzata da FIGE (Fig. 2d), e trasformata in sferoplasti lievito (11). In questa terza e fase finale di montaggio, una sequenza di vettore aggiuntivo non è stato richiesto, poiché il lievito clonazione elementi sono stati già presenti in assemblea 811-900.
Per schermo per un genoma completo, PCR multiplex è stata effettuato con 11 coppie di primer, progettato per occupare ciascuno dei undici svincoli di montaggio di 100 kb (S3 tabella). Di 48 colonie schermato, DNA estratto da un clone (sMmYCp235) prodotte tutte le 11 ampliconi. PCR di tipo selvatico (WT) controllo positivo (YCpMmyc1.1) ha prodotto un insieme indistinguibile di 11 ampliconi (Fig. 3a). Per ulteriori dimostrare l’assemblaggio completo di un sintetico M. mycoides genoma, il DNA intatto è stato isolato da lievito in spine agarosio e sottoposto a due analisi di restrizione; Asc I BssH e II (11). Dato che questi siti di restrizione sono presenti in tre delle quattro sequenze di filigrana, questa scelta di digestione produce modelli di restrizione che si distinguono dai il naturale M. mycoides genoma (figg. 1 e 3b). Il sMmYCp235 clone prodotto il profilo di restrizione attesi per un genoma sintetico completamente montato (Fig. 3c).

pSynthetic trapianto di genoma
spine agarosio Ulteriori utilizzati per l’analisi di gel sopra (Fig. 3c) sono stati utilizzati anche in esperimenti di trapianto del genoma (11). Intatto genoma sintetico signor mycoides dal sMmYCp235 clone lievito sono stati trapiantati in restrictionminus M. capricolum cellule riceventi, come descritto (8). Risultati sono stati segnati da selezionare per la crescita di colonie blu sulla SP4 supporto contenente tetraciclina e X-gal a 37 ° C. Genomi isolati da questo clone lievito ottenuto tetracyclineresistant 5-15 colonie blu per agarosio spina. Questo è stato comparabile al controllo YCpMmyc1.1. Il recupero delle colonie in tutti i esperimenti di trapianto è stato dipendente dalla presenza di entrambe le celle M. destinatario capricolum e un M. mycoides genoma.

Semi-sintetico di assemblaggio e il trapianto di genoma
Per facilitare la verifica della funzionalità di ogni 100 kb sintetico genomi segmento, semi-sintetico sono state costruite e trapiantati. Miscelando pezzi naturali con quelli sintetici, la costruzione di successo di ogni assemblea sintetico da 100 kb hanno potuto essere verificate, senza dover sequenza di queste intermedi. Abbiamo clonato 11 sovrapposizione naturale da 100 kb assemblee in lievito utilizzando un metodo precedentemente descritto (16). In 11 reazioni parallele, cellule di lievito sono stati co-trasformato con M. mycoides frammentato genomic DNA (YCpMmyc 1.1) che in media ~ 100 kb di lunghezza e una PCR-amplificato vettore progettati per sovrapporsi alle estremità degli inserti di 100 kb. A mantenere le sovrapposizioni appropriate affinché naturali e sintetici frammenti possono essere ricombinati, i vettori PCR-amplificato sono stati prodotti tramite iniettori con le sovrapposizioni di 40 bp stesso usato per clonare le assemblee di 100 KB di sintesi. Il semi-sintetico genomi che sono stati costruiti contenuta tra due e dieci degli undici sottoinsiemi di 100 kb di sintesi (tabella 1). La produzione di colonie vitali prodotti dopo trapianto, ionfirmed che la frazione di sintesi di ogni genoma non contiene mutazioni letali. Solo uno dei 100 – sottoinsiemi kb, 811-900, non era praticabile.
Inizialmente, un messaggio di errore contenente 811-820 clone è stato utilizzato per produrre un genoma sintetico che non il trapianto. Questo è stato atteso poiché l’errore è stato un unico cancellazione coppia di basi che crea un frameshift in dnaA, un gene essenziale per replicazione dei cromosomi. Eravamo già a conoscenza di questa mutazione. Utilizzando una costruzione semi-sintetico del genoma strategia, siamo stati in grado di individuare 811-900 come origine per fallito esperimenti di trapianto di sintesi. Così, abbiamo iniziato di rimontare un errore privo di 811-900 assemblea, che è stato utilizzati per produrre lo sforzo sMmYCp235 lievito. Il dnaAmutated genoma differisce solo per un nucleotide del genoma sintetico in sMmYCp235. Questo genoma servito da controllo negativo nei nostri esperimenti di trapianto. Il dnaA mutazione è stata riparata anche a livello di 811-900 da genoma ingegneria nel lievito (17). Un assembly è stato riparato 811-900 utilizzato in una fase finale di assemblaggio per produrre un clone di lievito con un riparazione del genoma. Questo clone è chiamato lievito sMmYCP142 e potrebbero essere trapiantati. Un elenco completo dei genomi che
? sono stati assemblati da 11 pezzi e con successo trapiantato è previsto nella tabella 1.

Caratterizzazione dei trapianti di sintesi
Per distinguere rapidamente i trapianti di sintesi provenienti da M. capricolum o naturale mycoides M., due analisi sono state eseguita. In primo luogo, quattro coppie di primer che sono specifici per ciascuna delle i quattro filigrane sono stati progettati in modo tale che essi producono ampliconi quattro in una singola reazione di PCR multiplex (tabella S4). Tutti e quattro gli ampliconi sono stati prodotti da trapianto generata da sMmYCp235, ma non YCpMmyc1.1 (Fig. 4a). In secondo luogo, l’analisi gel con Asc I e II BssH, descritto in precedenza (Fig. 3D), è stata effettuata. Il pattern di restrizione ottenuto è stato coerente con un trapianto di prodotto da un sintetico M. mycoides genoma (Fig. 4b).
Un trapianto singolo provenienti dal sMmYCp235 genoma sintetico è stato sequenziato. Ci riferiamo a questo ceppo di M. mycoides JCVI-syn1.0. La sequenza ha riscontrato l’intesa design con l’eccezione dei polimorfismi noti, 8 nuovi polimorfismi di singoli nucleotidi, un trasposone E. coli inserimento, e di una duplicazione di 85 bp (tabella S1). I trasposoni inserimento corrisponde esattamente la dimensione e la sequenza di IS1, un trasposone in E. coli. E ‘probabile che IS1 infetto il 10-KB sub-assemblaggio seguito del suo trasferimento in E. coli. L’inserto IS1 è fiancheggiata da ripetizioni dirette di M. mycoides successione suggerendo che è stato inserito da un meccanismo di recepimento. La duplicazione di 85 bp è il risultato di un non-omologa end evento che unisce, non è stata rilevata nella nostra sequenza analisi in fase di 10 kb. Questi due inserimenti disturbare due geni che sono evidentemente non essenziali. Non abbiamo trovato alcuna le sequenze del genoma sintetico che potrebbe essere identificata come appartenenti a capricolum M.. Questo indica che c’è stato un la sostituzione completa del genome capricolum M. dal nostro genoma sintetico durante il processo di trapianto.
Le celle con solo il genoma sintetico sono auto replica e capace di una crescita logaritmica. Scansione e microscopio elettronico a trasmissione (EM) di M. mycoides JCVI-syn1.0 celle mostrano piccole celle ovoidale circondato da membrane citoplasmatica (Fig. 5c-5F). Analisi di proteomica M. mycoides JCVI-syn1.0 e il WT di controllo (YCpMmyc1.1) di due-dimensionale elettroforesi su gel rivelato pressoché identico pattern di macchie proteine (fig. S4) e questi erano chiaramente diversi da quelli precedentemente riportati per capricolum M. (10). Quattordici i geni sono soppresse o interrotto in M. mycoides JCVI-syn1.0 genoma, Tuttavia, il tasso di comparsa di colonie su piastre di agar e la morfologia delle colonie sono simili (confronta fig. 5a e b). Abbiamo fatto osservare differenze nei tassi di crescita in un colore fasciatoio test, con la JCVI-syn1.0 trapianti crescita leggermente più veloce rispetto al controllo MmcyYCp1.1 ceppo (Fig. S6).

Discussione
Nel 1995, lo standard di qualità per il sequenziamento è stato considerato da un errore su 10.000 bp e il sequenziamento di un microbica mesi genoma richiesto. Oggi, la precisione è decisamente più elevati. copertura del genoma di 30-50X non è insolito e sequenziamento richiede solo pochi giorni. Tuttavia, ottenere un genoma privo di errori che potrebbero essere trapiantate in destinatario di una cella per creare una nuova cella controllata solo dalla genoma sintetico è stato complicato e ha richiesto molte qualità controllo passi. Il nostro successo è stato sventato per molte settimane da un singola coppia di soppressione di base per le dnaA gene essenziale. Uno base sbagliata su oltre un milione in un gene essenziale rese inattivo il genoma, mentre i principali inserimenti genoma e le eliminazioni nelle parti non essenziali del genoma non ha avuto conseguenze osservabili redditività. La dimostrazione che la nostra genoma sintetico dà luogo a trapianto con la caratteristiche delle cellule M. mycoides implica che il DNA sequenza su cui si basa è abbastanza accurati da specificare una cellula vivente, con le proprietà appropriate.
Il nostro approccio sintetico genomica sta in netto contrasto con una varietà di approcci diversi al genoma di ingegneria che modificare genomi naturali con l’introduzione di inserimenti multipli, sostituzioni o eliminazioni (18-22). Questo lavoro fornisce un prova di principio per la produzione di celle sulla base genoma sequenze progettate nel computer. sequenziamento del DNA di un genoma cellulare consente la memorizzazione delle istruzioni genetiche per la vita come un file digitale. Il genoma sintetico descritto in questo carta è solo modifiche limitate dalla natura che si verificano M. mycoides genoma. Tuttavia, l’approccio che abbiamo hanno messo a punto dovrebbero essere applicabili alla sintesi e trapianto di genomi romanzo più come design genoma avanza (23).
Ci riferiamo a una tale cella controllata da un genoma assemblato da sintesi chimica pezzi di DNA come un “sintetico cella “, anche se il citoplasma della cellula ricevente non è sintetico. effetti fenotipici del citoplasma destinatario sono diluito con un fatturato di proteine e le cellule che trasportano solo il trapiantati genoma replicare. A seguito di trapianto e replica su un piatto a formare una colonia (> 30 divisioni o> 109 diluizione volte), la progenie non conterrà molecole di proteina che erano presenti nella cella originale destinatario (10, 24). Questo è stato precedentemente dimostrato quando abbiamo descritto genoma trapianto (10). Le proprietà delle cellule controllata da il genoma assemblato dovrebbero essere gli stessi, come se il cellula intera era stata prodotta sinteticamente (il DNA software costruisce il proprio hardware).
Il tp capacità di produrre cellule sintetiche lo rende essenziale per i ricercatori rendere DNA sintetico costrutti e delle cellule chiaramente filigrana il loro lavoro per distinguerla dalla natura che si verificano sul DNA e delle cellule. Abbiamo filigrana il sintetico cromosoma in questo e il nostro precedente studio (7).
? Se i metodi qui descritti possono essere generalizzate, design, sintesi, assemblaggio, e il trapianto di sintesi cromosomi non sarà più un ostacolo al progresso della biologia sintetica. Ci aspettiamo che il costo della sintesi del DNA seguirà quello che è successo con il sequenziamento del DNA e continuano a diminuire in modo esponenziale. Abbassare i costi di sintesi combinato con l’automazione consentirà di massima per le applicazioni genomica sintetica.
Siamo stati la guida del dibattito etico in materia vita sintetica dalle prime fasi di questo lavoro (25, 26). Come applicazioni di genomica sintetica espandersi, possiamo anticipare che questa il lavoro continuerà a sollevare questioni filosofiche che hanno ampio implicazioni sociali ed etiche. Incoraggiamo l’ discorso continuato.
Riferimenti e note
1. F. Sanger et al., Nature 265, 687 (Feb 24, 1977).
2. Fleischmann RD et al. Science 269, 496 (28 lug 1995).
3. J. Venter C., Nature 464, 676 (1 aprile).
4. Hutchison CA et al. Science 286, 2165 (dic 10, 1999).
5. Vetro JI et al. Proc Natl Acad Sci USA 103, 425 (Jan 10, 2006).
6. HO Smith, Glass JI, CA Hutchison III, JC Venter, Accesso a microrganismi Incolto: Dalla Ambiente per gli organismi e genomi e Back K. Zengler, Ed. (ASM Press, Washington, 2008), pp. 320.
7. DG Gibson et al. Science 319, 1215 (Feb 29, 2008).
8. Lartigue C. et al. Science 325, 1693 (25 Set, 2009).
9. Benders GA et al. Acidi Nucleici, (Mar 7, 2010).
10. Lartigue C. et al. Science 317, 632 (3 Agosto 2007).
11. Ulteriori informazioni sono disponibili su Science Online.
12. DG Gibson, Acidi Nucleici 37, 6.984 (, novembre 2009).
13. DG Gibson et al. Proc Natl Acad Sci USA 105, 20.404 (23 dicembre 2008).
14. RJ Devenish, Newlon CS, Gene 18, 277 (, giugno 1982).
15. W. W. Dean, M. Dancis B., C. A. Thomas Jr., Anal Biochem 56, 417 (Dec, 1973).
16. LEEM SH et al. Acidi Nucleici 31, E29 (15 marzo, 2003).
17. V. N Noskov, T. H. Segall-Shapiro, R. Chuang Y., Acidi Nucleici 38, 2570 (1 maggio).
18. M. Itaya, K. Tsuge, M. Koizumi, K. Fujita, Proc Natl U Acad Sci A 102 S, 15.971 (Nov 1, 2005).
19. M. Itaya, FEBS Lett 362, 257 (Apr 10, 1995).
20. H. Mizoguchi, H. Mori, T. Fujio, biotecnologie Appl Biochem 46, 157 (Mar, 2007).
21. Chun JY et al. Acidi Nucleici 35, E40 (2007).
22. HH Wang et al., Nature 460, 894 (13 agosto 2009).
23. Collins Khalil, JJ, Nat Genet Ap 11, 367 (maggio).
24. Una cellula micoplasma, con una massa di cellule di circa 10-13 g, contiene meno di 106 molecole di proteina. (Se contiene il 20% di proteine si tratta di 2 x 10-14 g di proteine per cella. A un peso molecolare di 120 dalton per residui di aminoacidi ogni cella contiene (2 x 10-14) / 120 = 1.7 x 10-16 moli di peptide residui. Questo è di 1,7 x 10-16 x 6 x 1023 = 1 x 108 residui per cella. Se la dimensione media di una proteina è di 300 residui allora una cella contiene circa 3 x 105 proteine molecole.) Dopo 20 divisioni cellulari il numero di discendenti supera il numero totale di molecole proteiche presenti nel la cellula ricevente. Così, dopo il trapianto e replica a formare una colonia su un piatto, la maggior parte delle cellule si non contengono molecole proteiche che erano presenti nel originale cellula ricevente.
25. MK Cho, D. Magnus, Caplan AL, D. McGee, Scienza 286 del 2087 (10 Dicembre 1999).
26. MS Garfinkel, D. Endy, Epstein GE, Friedman RM. (2007).
27. DG Gibson et al. Metodi Nat 6, 343 (maggio 2009).
28. Ringraziamo Synthetic Genomics, Inc. per il generoso finanziamento di questo lavoro. Ringraziamo J. B. Hostetler, D. Radune, N. B. Fedorova, Kim MD, BJ Szczypinski, Singh IK, JR Miller, S. Kaushal, Friedman RM, e J. Mulligan per il loro contributo a questo lavoro. Electron micrografie sono stati gentilmente forniti da T. Deerinck e M. Ellisman del Centro nazionale per la microscopia e Imaging Ricerca presso l’Università della California a San Diego. J.C.V. è Chief Executive Officer e Co-direttore scientifico Officer di SGI. H.O.S. è Co-Direttore Scientifico e il Consiglio di Amministrazione di SGI. C.A.H. è presidente della SGI il Comitato Scientifico. Tutti e tre questi autori e JCVI detenere stock SGI. JCVI ha depositato brevetti applicazioni su alcune delle tecniche descritte nel presente carta.

Materiale di supporto online
http://www.sciencemag.org/cgi/content/full/science.1190719/DC1
Materiali e Metodi
Fichi. S1 a S6
Tavoli da S1 a S7
Riferimenti
9 aprile 2010; accettato 13 Maggio 2010 Pubblicato online il 20 maggio 2010; 10.1126/science.1190719 Includere queste informazioni quando citando questo articolo.
Fig. 1. Il montaggio di una sintetica M. mycoides genoma in lievito. Un genoma sintetico M. mycoides è stato assemblato da 1.078 cassette di DNA sovrapposti in tre fasi. Nel primo passo, 1.080-bp cassette (frecce arancioni), prodotto da sovrapposizione oligonucleotidi sintetici, sono stati ricombinati in confezioni da 10 pezzi per la produzione di assemblaggi 109 ~ 10 KB (Frecce blu). Questi sono stati poi ricombinati in confezioni da 10 a produrre undici assemblee ~ 100 KB (frecce verdi). Nel fase finale di montaggio, questi frammenti undici ricombinato nel genoma completo (cerchio rosso). Con l’
? tranne il 2 costrutti che sono stati enzimaticamente pieced insieme in vitro (27) (frecce bianche), le assemblee sono state effettuate da in vivo ricombinazione omologa in lievito. Grande variazioni rispetto al genoma naturale sono mostrati in giallo cerchi. Questi includono 4 Regioni filigranata (WM1-WM4), una regione da 4 KB che è stato volutamente cancellato (94 quinquies), e elementi per la crescita nel lievito e il trapianto di genoma. In Inoltre, vi sono 20 località con nucleotide polimorfismi (asterischi). Coordinate del genoma sono rispetto al primo nucleotide del M. mycoides naturale sequenza. La sequenza è progettato 1.077.947 bp. Il I luoghi della Asc e BssH siti di restrizione II sono mostrate. Cassette 1 e 800-810 sono stati inutili e rimossi dal la strategia di assemblaggio (11). Cassetta 2 sovrapposizioni cassette 1104 799 e cassette sovrapposizioni cassetta 811.
Fig. 2. L’analisi degli intermedi di montaggio. (A) Non io e SBF faccio doppio digestione analisi di restrizione di montaggio 341 – 350 purificato da E. coli. Questi enzimi di restrizione di rilascio i frammenti vettore (5,5 kb e 3,4 kb) dal-10 kb Inserisci. Inserisci il DNA è stato separato dal DNA di vettore su un 0,8% E-gel (Invitrogen). M indica la scala del DNA di 1 kb (Biolabs New England, NEB). (B) Analisi del montaggio 501 – 600 purificato da lievito. I cerchi a 105 kb (100 kb inserire più 5-kb vettore) sono stati separati dal lievito lineare DNA cromosomico di un 1% gel mediante l’applicazione di 4,5 V / cm per 3 ore. S indica il BAC-Tracker supercoiled DNA ladder (Epicentre). (C) Non ho restrizione digestione analisi delle undici assemblee ~ 100 kb purificato da lievito. Questi frammenti di DNA sono stati analizzati da FIGE su un 1% gel di agarosio. Le dimensioni inserto previsto per ogni assemblea è indicato. . indica la scala lambda (NEB). (D) Analisi delle 11 assemblee riunite in (c) a seguito cattura topologiche del DNA circolare e non ho la digestione. Un quarantesimo del DNA usato per trasformare il lievito è rappresentati.
Fig. 3. Caratterizzazione del genoma sintetico isolato dal lievito. (A) cloni di lievito contenente una completamente assemblato genoma sintetici sono stati esaminati da PCR multiplex con un primer set che produce 11 ampliconi, uno in ciascuna delle 11 montaggio dei raccordi. Lievito clone sMmYCp235 (235) prodotto i 11 prodotti di PCR attesi per una completa assemblaggio del genoma. Per confronto, il genoma naturale estratto dal lievito (WT) è stato anche analizzato. Prodotti di PCR sono stati separati su un 2% E-gel (Invitrogen). L indica il 100-bp ladder (NEB). (B) Le dimensioni del previsto Asc I e BssH frammenti di restrizione II per naturale (WT) e sintetiche (Syn235) M. mycoides genomi. (C) Naturale (WT) e sintetici (235) M. mycoides genomi sono stati isolati da lievito in spine agarosio. Inoltre, il DNA è stato purificato da il ceppo ospite da solo (H). tappi di agarosio sono stati digeriti con Asc I o II BssH e frammenti sono stati separati da serrate omogenea campo elettrico (Chef) elettroforesi su gel. Frammenti di restrizione corrispondenti alle dimensioni corrette sono indicato dai numeri frammento mostrato in (b).
Fig. 4. Caratterizzazione dei trapianti. (A) Trapianti contenente un genoma sintetico sono stati esaminati da multiplex PCR con un set di primer che produce 4 ampliconi, uno interno a ciascuno dei quattro filigrane. Un trapianto (syn1.0) provenienti da lievito clone sMmYCp235 è stato analizzato accanto ad una naturale, genoma non sintetici (WT) trapiantati di lievito. Il trapianto del genoma sintetico contenente prodotto i 4 prodotti PCR mentre il genoma WT ha non producono alcun. I prodotti di PCR sono stati separati su un 2% E-gel (Invitrogen). (B) Naturale (WT) e sintetiche (syn1.0) M. mycoides genomi sono stati isolati da M. mycoides trapianti di spine agarosio. spine agarosio sono stati digeriti con Asc I o II BssH e frammenti sono stati separati da CHEF elettroforesi su gel. Frammenti di restrizione corrispondenti a le dimensioni corrette sono indicate con i numeri frammento mostrato in fig. 3 ter.
Fig. 5. Immagini di M. mycoides JCVI-syn1.0 e WT M. mycoides. Per confrontare il fenotipo del JCVI-syn1.0 e non YCP ceppi WT, abbiamo esaminato la morfologia colonia placcatura cellule su piastre contenenti agar SP4 X-gal. Tre giorni dopo la placcatura, il syn1.0 colonie JCVI sono blu perché il cellule contengono il gene lacZ ed esprimere la beta-galattosidasi, che converte l’X-gal di un composto blu (a). Il WT le cellule non contengono lacZ e rimangono bianche (b). Entrambi i cellulari i tipi hanno la caratteristica uovo fritto colonia morfologia del maggior parte dei micoplasmi. EMs sono state fatte delle JCVI-syn1.0 isolare utilizzando due metodi. (C) per la scansione EM, i campioni sono stati post-fissati in tetrossido di osmio, disidratata e critica punto secco con la CO2, e visualizzati utilizzando un SU6600 Hitachi SEM del 2,0 keV. (D) EMS trasmissione Negativamente macchiato di cellule in divisione con 1% di acetato di uranile in carbonio puro substrato visualizzato per mezzo di JEOL 1200EX CTEM a 80 keV. Per esaminare la morfologia delle cellule, abbiamo confrontato di acetato di uranile EM macchiato di M. mycoides JCVI-syn1.0 cellule (e) con EMS di cellule WT effettuati nel 2006 che sono stati colorati con ammonio molibdato (f). Entrambi i tipi di cellule mostrano la stessa ovoidale morfologia e l’aspetto generale. EM sono stati forniti da Tom Deerinck e Ellisman Mark of the National Center for Microscopia e Imaging Research presso l’Università di California a San Diego.
? Tabella 1. Genomi che sono stati assemblati da 11 pezzi e trapiantate con successo. Assemblea 200-100 = 1, il montaggio 101 – 200 = 2, assemblea 201-300 = 3, 301-400 = 4 montaggio, assemblaggio 401-500 = 5, assemblea 501-600 = 6, il montaggio 601-700 = 7, montaggio 701-799 = 8, il montaggio 811-900 = 9, assemblea 901-1.000 = 10, assemblea 1001-1104 = 11. WM indica filigranata montaggio.

Genoma Assemblea
Sintetico Frammenti
Naturale Frammenti
Ricostituita genoma naturale
Nessuno
1-11
2 / 11 del genoma semi-sintetico con 1 filigrana
5WM, 10
1-4, 6-9, 11
8 / 11 genoma semi-sintetico senza watermark
1-4, 6-8, 11
5, 9, 10
9 / 11 genoma semi-sintetico senza watermark
1-4, 6-8, 10-11
5, 9
9 / 11 genoma semi-sintetico di 3 filigrane
1, 2WM, 3WM, 4, 6, 7WM, 8, 10-11
5, 9
10/11 genoma semi-sintetico di 3 filigrane
1, 2WM, 3WM, 4, 5WM, 6, 7WM, 8, 10-11
9
11/11 genoma sintetico, 811-820 correzione del dnaA
1, 2WM, 3WM, 4, 5WM, 6, 7WM, 8, 9-11
Nessuno
11/11 genoma sintetico, 811-900 correzione del dnaA
1, 2WM, 3WM, 4, 5WM, 6, 7WM, 8, 9-11
Nessuno

? Contribuisci a una traduzione migliore©2010

Creation of a Bacterial Cell Controlled by a Chemically Synthesized Genome

Daniel G. Gibson,1 John I. Glass,1 Carole Lartigue,1 Vladimir N. Noskov,1 Ray-Yuan Chuang,1 Mikkel A.

Algire,1 Gwynedd A. Benders,2 Michael G. Montague,1 Li Ma,1 Monzia M. Moodie,1 Chuck Merryman,1

Sanjay Vashee,1 Radha Krishnakumar,1 Nacyra Assad-Garcia,1 Cynthia Andrews-Pfannkoch,1 Evgeniya A.

Denisova,1 Lei Young,1 Zhi-Qing Qi,1 Thomas H. Segall-Shapiro,1 Christopher H. Calvey,1 Prashanth P.

Parmar,1 Clyde A. Hutchison III,2 Hamilton O. Smith,2 J. Craig Venter1,2*

1The J. Craig Venter Institute, 9704 Medical Center Drive, Rockville, MD 20850, USA. 2The J. Craig Venter Institute, 10355

Science Center Drive, San Diego, CA 92121, USA.

*To whom correspondence should be addressed. E-mail: jcventer@jcvi.org

We report the design, synthesis and assembly of the 1.08-

Mbp Mycoplasma mycoides JCVI-syn1.0 genome starting

from digitized genome sequence information and its

transplantation into a Mycoplasma capricolum recipient

cell to create new Mycoplasma mycoides cells that are

controlled only by the synthetic chromosome. The only

DNA in the cells is the designed synthetic DNA sequence,

including “watermark” sequences and other designed

gene deletions and polymorphisms, and mutations

acquired during the building process. The new cells have

expected phenotypic properties and are capable of

continuous self-replication.

In 1977, Sanger and colleagues determined the complete

genetic code of phage fX174 (1), the first DNA genome to be

completely sequenced. Eighteen years later, in 1995, our team

was able to read the first complete genetic code of a selfreplicating

bacterium, Haemophilus influenzae (2). Reading

the genetic code of a wide range of species has increased

exponentially from these early studies. Our ability to rapidly

digitize genomic information has increased by more than

eight orders of magnitude over the past 25 years (3). Efforts

to understand all this new genomic information have spawned

numerous new computational and experimental paradigms,

yet our genomic knowledge remains very limited. No single

cellular system has all of its genes understood in terms of

their biological roles. Even in simple bacterial cells, do the

chromosomes contain the entire genetic repertoire? If so, can

a complete genetic system be reproduced by chemical

synthesis starting with only the digitized DNA sequence

contained in a computer?

Our interest in synthesis of large DNA molecules and

chromosomes grew out of our efforts over the past 15 years to

build a minimal cell that contains only essential genes. This

work was inaugurated in 1995 when we sequenced the

genome from Mycoplasma genitalium, a bacterium with the

smallest complement of genes of any known organism

capable of independent growth in the laboratory. More than

100 of the 485 protein-coding genes of M. genitalium are

dispensable when disrupted one-at-a-time (4–6).

We developed a strategy for assembling viral sized pieces

to produce large DNA molecules that enabled us to assemble

a synthetic M. genitalium genome in four stages from

chemically synthesized DNA cassettes averaging about 6 kb

in size. This was accomplished through a combination of in

vitro enzymatic methods and in vivo recombination in

Saccharomyces cerevisiae. The whole synthetic genome

(582,970 bp) was stably grown as a yeast centromeric

plasmid (YCp) (7).

Several hurdles were overcome in transplanting and

expressing a chemically synthesized chromosome in a

recipient cell. We needed to improve methods for extracting

intact chromosomes from yeast. We also needed to learn how

to transplant these genomes into a recipient bacterial cell to

establish a cell controlled only by a synthetic genome. Due to

the fact that M. genitalium has an extremely slow growth rate,

we turned to two faster growing mycoplasma species, M.

mycoides subspecies capri (GM12) as donor, and M.

capricolum subspecies capricolum (CK) as recipient.

To establish conditions and procedures for transplanting

the synthetic genome out of yeast, we developed methods for

cloning entire bacterial chromosomes as centromeric

plasmids in yeast, including a native M. mycoides genome (8,

9). However, initial attempts to extract the M. mycoides

genome from yeast and transplant it into M. capricolum

failed. We discovered that the donor and recipient

mycoplasmas share a common restriction system. The donor

genome was methylated in the native M. mycoides cells and

was therefore protected against restriction during the

transplantation from a native donor cell (10). However, the

bacterial genomes grown in yeast are unmethylated and so are

not protected from the single restriction system of the

recipient cell. We were able to overcome this restriction

barrier by methylating the donor DNA with purified

methylases or crude M. mycoides or M. capricolum extracts,

or by simply disrupting the recipient cell’s restriction system

(8).

We now have combined all of our previously established

procedures and report the synthesis, assembly, cloning, and

successful transplantation of the 1.08-Mbp M. mycoides

JCVI-syn1.0 genome, to create a new cell controlled by this

synthetic genome.

Results

Synthetic genome design

Design of the M. mycoides JCVI-syn1.0 genome was based

on the highly accurate finished genome sequences of two

laboratory strains of M. mycoides subspecies capri GM12 (8,

9) (11). One was the genome donor used by Lartigue et al.

[GenBank accession CP001621] (10). The other was a strain

created by transplantation of a genome that had been cloned

and engineered in yeast, YCpMmyc1.1-.typeIIIres,

[GenBank accession CP001668] (8). This project was

critically dependent on the accuracy of these sequences.

Although we believe that both finished M. mycoides genome

sequences are reliable, there are 95 sites at which they differ.

We began to design the synthetic genome before both

sequences were finished. Consequently, most of the cassettes

were designed and synthesized based upon the CP001621

sequence (11). When it was finished, we chose to use the

sequence of the genome successfully transplanted from yeast

(CP001668) as our design reference (except that we kept the

intact typeIIIres gene). All differences that appeared

biologically significant between CP001668 and previously

synthesized cassettes were corrected to match it exactly (11).

Sequence differences between our synthetic cassettes and

CP001668 that occurred at 19 sites appeared harmless, and so

were not corrected. These provide 19 polymorphic

differences between our synthetic genome (JCVI-syn1.0) and

the natural (non-synthetic) genome (YCpMmyc1.1) that we

have cloned in yeast and use as a standard for genome

transplantation from yeast (8). To further differentiate

between the synthetic genome and the natural one, four

watermark sequences (fig. S1) were designed to replace one

or more cassettes in regions experimentally demonstrated

(watermarks 1 [1246 bp] and 2 [1081 bp]) or predicted

(watermarks 3 [1109 bp] and 4 [1222 bp]) to not interfere

with cell viability. These watermark sequences encode unique

identifiers while limiting their translation into peptides. Table

S1 lists the differences between the synthetic genome and this

natural standard. Figure S2 shows a map of the M. mycoides

JCVI-syn1.0 genome. Cassette and assembly intermediate

boundaries, watermarks, deletions, insertions, and genes of

the M. mycoides JCVI syn1.0 are shown in fig. S2, and the

sequence of the transplanted mycoplasma clone

sMmYCp235-1 has been submitted to GenBank (accession #

CP002027).

pSynthetic genome assembly strategy

The designed cassettes were generally 1,080 bp with 80-bp

overlaps to adjacent cassettes (11). They were all produced by

assembly of chemically synthesized oligonucleotides by Blue

Heron; Bothell, Washington. Each cassette was individually

synthesized and sequence-verified by the manufacturer. To

aid in the building process, DNA cassettes and assembly

intermediates were designed to contain Not I restriction sites

at their termini, and recombined in the presence of vector

elements to allow for growth and selection in yeast (7) (11).

pA hierarchical strategy was designed to assemble the

genome in 3 stages by transformation and homologous

recombination in yeast from 1,078 one-kb cassettes (Fig. 1)

(12, 13).

Assembly of 10-kb synthetic intermediates. In the first

stage, cassettes and a vector were recombined in yeast and

transferred to E. coli (11). Plasmid DNA was then isolated

from individual E. coli clones and digested to screen for cells

containing a vector with an assembled 10-kb insert. One

successful 10-kb assembly is represented (Fig. 2a). In

general, at least one 10-kb assembled fragment could be

obtained by screening 10 yeast clones. However, the rate of

success varied from 10-100%. All of the first-stage

intermediates were sequenced. Nineteen out of 111

assemblies contained errors. Alternate clones were selected,

sequence-verified, and moved on to the next assembly stage

(11).

Assembly of 100-kb synthetic intermediates. The pooled

10-kb assemblies and their respective cloning vectors were

transformed into yeast as above to produce 100-kb assembly

intermediates (11). Our results indicated that these products

cannot be stably maintained in E. coli so recombined DNA

had to be extracted from yeast. Multiplex PCR was performed

on selected yeast clones (fig. S3 and table S2). Because every

10-kb assembly intermediate was represented by a primer pair

in this analysis, the presence of all amplicons would suggest

an assembled 100-kb intermediate. In general, 25% or more

of the clones screened contained all of the amplicons

expected for a complete assembly. One of these clones was

selected for further screening. Circular plasmid DNA was

extracted and sized on an agarose gel alongside a supercoiled

marker. Successful second-stage assemblies with the vector

sequence are approximately 105 kb in length (Fig. 2b). When

all amplicons were produced following multiplex PCR, a

second-stage assembly intermediate of the correct size was

usually produced. In some cases, however, small deletions

occurred. In other instances, multiple 10-kb fragments were

assembled, which produced a larger second-stage assembly

intermediate. Fortunately, these differences could easily be

detected on an agarose gel prior to complete genome

assembly.

Complete genome assembly. In preparation for the final

stage of assembly, it was necessary to isolate microgram

quantities of each of the 11 second-stage assemblies (11). As

reported (14), circular plasmids the size of our second-stage

assemblies could be isolated from yeast spheroplasts after an

alkaline-lysis procedure. To further purify the 11 assembly

intermediates, they were exonuclease-treated and passed

through an anion-exchange column. A small fraction of the

total plasmid DNA (1/100th) was digested with Not I and

analyzed by field-inversion gel electrophoresis (FIGE) (Fig.

2c). This method produced ~1 µg of each assembly per 400

ml yeast culture (~1011 cells).

The method above does not completely remove all of the

linear yeast chromosomal DNA, which we found could

significantly decrease the yeast transformation and assembly

efficiency. To further enrich for the eleven circular assembly

intermediates, ~200 ng samples of each assembly were

pooled and mixed with molten agarose. As the agarose

solidifies, the fibers thread through and topologically “trap”

circular DNA (15). Untrapped linear DNA can then be

electrophoresed out of the agarose plug, thus enriching for the

trapped circular molecules. The eleven circular assembly

intermediates were digested with Not I so that the inserts

could be released. Subsequently, the fragments were

extracted from the agarose plug, analyzed by FIGE (Fig. 2d),

and transformed into yeast spheroplasts (11). In this third and

final stage of assembly, an additional vector sequence was not

required since the yeast cloning elements were already

present in assembly 811-900.

To screen for a complete genome, multiplex PCR was

carried out with 11 primer pairs, designed to span each of the

eleven 100-kb assembly junctions (table S3). Of 48 colonies

screened, DNA extracted from one clone (sMmYCp235)

produced all 11 amplicons. PCR of the wild type (WT)

positive control (YCpMmyc1.1) produced an

indistinguishable set of 11 amplicons (Fig. 3a). To further

demonstrate the complete assembly of a synthetic M.

mycoides genome, intact DNA was isolated from yeast in

agarose plugs and subjected to two restriction analyses; Asc I

and BssH II (11). Because these restriction sites are present in

three of the four watermark sequences, this choice of

digestion produces restriction patterns that are distinct from

the natural M. mycoides genome (Figs. 1 and 3b). The

sMmYCp235 clone produced the restriction pattern expected

for a completely assembled synthetic genome (Fig. 3c).

pSynthetic genome transplantation

Additional agarose plugs used in the gel analysis above (Fig.

3c) were also used in genome transplantation experiments

(11). Intact synthetic M. mycoides genomes from the

sMmYCp235 yeast clone were transplanted into restrictionminus

M. capricolum recipient cells, as described (8). Results

were scored by selecting for growth of blue colonies on SP4

medium containing tetracycline and X-gal at 37 °C. Genomes

isolated from this yeast clone produced 5-15 tetracyclineresistant

blue colonies per agarose plug. This was comparable

to the YCpMmyc1.1 control. Recovery of colonies in all

transplantation experiments was dependent on the presence of

both M. capricolum recipient cells and an M. mycoides

genome.

Semi-synthetic genome assembly and transplantation

To aid in testing the functionality of each 100-kb synthetic

segment, semi-synthetic genomes were constructed and

transplanted. By mixing natural pieces with synthetic ones,

the successful construction of each synthetic 100-kb assembly

could be verified without having to sequence these

intermediates. We cloned 11 overlapping natural 100-kb

assemblies in yeast by using a previously described method

(16). In 11 parallel reactions, yeast cells were co-transformed

with fragmented M. mycoides genomic DNA (YCpMmyc

1.1) that averaged ~100 kb in length and a PCR-amplified

vector designed to overlap the ends of the 100-kb inserts. To

maintain the appropriate overlaps so that natural and synthetic

fragments could be recombined, the PCR-amplified vectors

were produced via primers with the same 40-bp overlaps used

to clone the 100-kb synthetic assemblies. The semi-synthetic

genomes that were constructed contained between two and

ten of the eleven 100-kb synthetic subassemblies (Table 1).

The production of viable colonies produced after

transplantation, ionfirmed that the synthetic fraction of each

genome contained no lethal mutations. Only one of the 100-

kb subassemblies, 811-900, was not viable.

Initially, an error-containing 811-820 clone was used to

produce a synthetic genome that did not transplant. This was

expected since the error was a single base pair deletion that

creates a frameshift in dnaA, an essential gene for

chromosomal replication. We were previously unaware of

this mutation. By using a semi-synthetic genome construction

strategy, we were able to pinpoint 811-900 as the source for

failed synthetic transplantation experiments. Thus, we began

to reassemble an error-free 811-900 assembly, which was

used to produce the sMmYCp235 yeast strain. The dnaAmutated

genome only differs by one nucleotide from the

synthetic genome in sMmYCp235. This genome served as a

negative control in our transplantation experiments. The dnaA

mutation was also repaired at the 811-900 level by genome

engineering in yeast (17) . A repaired 811-900 assembly was

used in a final stage assembly to produce a yeast clone with a

repaired genome. This yeast clone is named sMmYCP142

and could be transplanted. A complete list of genomes that

have been assembled from 11 pieces and successfully

transplanted is provided in Table 1.

Characterization of the synthetic transplants

To rapidly distinguish the synthetic transplants from M.

capricolum or natural M. mycoides, two analyses were

performed. First, four primer pairs that are specific to each of

the four watermarks were designed such that they produce

four amplicons in a single multiplex PCR reaction (table S4).

All four amplicons were produced by transplants generated

from sMmYCp235, but not YCpMmyc1.1 (Fig. 4a). Second,

the gel analysis with Asc I and BssH II, described above (Fig.

3d), was performed. The restriction pattern obtained was

consistent with a transplant produced from a synthetic M.

mycoides genome (Fig. 4b).

A single transplant originating from the sMmYCp235

synthetic genome was sequenced. We refer to this strain as M.

mycoides JCVI-syn1.0. The sequence matched the intended

design with the exception of the known polymorphisms, 8

new single nucleotide polymorphisms, an E. coli transposon

insertion, and an 85-bp duplication (table S1). The transposon

insertion exactly matches the size and sequence of IS1, a

transposon in E. coli. It is likely that IS1 infected the 10-kb

sub-assembly following its transfer to E. coli. The IS1 insert

is flanked by direct repeats of M. mycoides sequence

suggesting that it was inserted by a transposition mechanism.

The 85-bp duplication is a result of a non-homologous end

joining event, which was not detected in our sequence

analysis at the 10-kb stage. These two insertions disrupt two

genes that are evidently non-essential. We did not find any

sequences in the synthetic genome that could be identified as

belonging to M. capricolum. This indicates that there was a

complete replacement of the M. capricolum genome by our

synthetic genome during the transplant process.

The cells with only the synthetic genome are self

replicating and capable of logarithmic growth. Scanning and

transmission electron micrographs (EM) of M. mycoides

JCVI-syn1.0 cells show small, ovoid cells surrounded by

cytoplasmic membranes (Fig. 5c-5f). Proteomic analysis of

M. mycoides JCVI-syn1.0 and the WT control

(YCpMmyc1.1) by two-dimensional gel electrophoresis

revealed almost identical patterns of protein spots (fig. S4)

and these were clearly different from those previously

reported for M. capricolum (10). Fourteen genes are deleted

or disrupted in the M. mycoides JCVI-syn1.0 genome,

however the rate of appearance of colonies on agar plates and

the colony morphology are similar (compare Fig. 5a and b).

We did observe slight differences in the growth rates in a

color changing unit assay, with the JCVI-syn1.0 transplants

growing slightly faster than the MmcyYCp1.1 control strain

(fig. S6).

Discussion

In 1995, the quality standard for sequencing was considered

to be one error in 10,000 bp and the sequencing of a

microbial genome required months. Today, the accuracy is

substantially higher. Genome coverage of 30-50X is not

unusual, and sequencing only requires a few days. However,

obtaining an error-free genome that could be transplanted into

a recipient cell to create a new cell controlled only by the

synthetic genome was complicated and required many quality

control steps. Our success was thwarted for many weeks by a

single base pair deletion in the essential gene dnaA. One

wrong base out of over one million in an essential gene

rendered the genome inactive, while major genome insertions

and deletions in non-essential parts of the genome had no

observable impact on viability. The demonstration that our

synthetic genome gives rise to transplants with the

characteristics of M. mycoides cells implies that the DNA

sequence upon which it is based is accurate enough to specify

a living cell with the appropriate properties.

Our synthetic genomic approach stands in sharp contrast to

a variety of other approaches to genome engineering that

modify natural genomes by introducing multiple insertions,

substitutions, or deletions (18–22). This work provides a

proof of principle for producing cells based upon genome

sequences designed in the computer. DNA sequencing of a

cellular genome allows storage of the genetic instructions for

life as a digital file. The synthetic genome described in this

paper has only limited modifications from the naturally

occurring M. mycoides genome. However, the approach we

have developed should be applicable to the synthesis and

transplantation of more novel genomes as genome design

progresses (23).

We refer to such a cell controlled by a genome assembled

from chemically synthesized pieces of DNA as a “synthetic

cell”, even though the cytoplasm of the recipient cell is not

synthetic. Phenotypic effects of the recipient cytoplasm are

diluted with protein turnover and as cells carrying only the

transplanted genome replicate. Following transplantation and

replication on a plate to form a colony (>30 divisions or >109

fold dilution), progeny will not contain any protein molecules

that were present in the original recipient cell (10, 24). This

was previously demonstrated when we first described genome

transplantation (10). The properties of the cells controlled by

the assembled genome are expected to be the same as if the

whole cell had been produced synthetically (the DNA

software builds its own hardware).

The ability tp produce synthetic cells renders it it essential

for researchers making synthetic DNA constructs and cells to

clearly watermark their work to distinguish it from naturally

occurring DNA and cells. We have watermarked the synthetic

chromosome in this and our previous study (7).

If the methods described here can be generalized, design,

synthesis, assembly, and transplantation of synthetic

chromosomes will no longer be a barrier to the progress of

synthetic biology. We expect that the cost of DNA synthesis

will follow what has happened with DNA sequencing and

continue to exponentially decrease. Lower synthesis costs

combined with automation will enable broad applications for

synthetic genomics.

We have been driving the ethical discussion concerning

synthetic life from the earliest stages of this work (25, 26). As

synthetic genomic applications expand, we anticipate that this

work will continue to raise philosophical issues that have

broad societal and ethical implications. We encourage the

continued discourse.

References and Notes

1. F. Sanger et al., Nature 265, 687 (Feb 24, 1977).

2. R. D. Fleischmann et al., Science 269, 496 (Jul 28, 1995).

3. J. C. Venter, Nature 464, 676 (Apr 1).

4. C. A. Hutchison et al., Science 286, 2165 (Dec 10, 1999).

5. J. I. Glass et al., Proc Natl Acad Sci U S A 103, 425 (Jan

10, 2006).

6. H. O. Smith, J. I. Glass, C. A. Hutchison III, J. C. Venter,

in Accessing Uncultivated Microorganisms: From the

Environment to Organisms and Genomes and Back K.

Zengler, Ed. (ASM Press, Washington, 2008), pp. 320.

7. D. G. Gibson et al., Science 319, 1215 (Feb 29, 2008).

8. C. Lartigue et al., Science 325, 1693 (Sep 25, 2009).

9. G. A. Benders et al., Nucleic Acids Res, (Mar 7, 2010).

10. C. Lartigue et al., Science 317, 632 (Aug 3, 2007).

11. Supplementary information is available on Science

Online.

12. D. G. Gibson, Nucleic Acids Res 37, 6984 (Nov, 2009).

13. D. G. Gibson et al., Proc Natl Acad Sci U S A 105, 20404

(Dec 23, 2008).

14. R. J. Devenish, C. S. Newlon, Gene 18, 277 (Jun, 1982).

15. W. W. Dean, B. M. Dancis, C. A. Thomas, Jr., Anal

Biochem 56, 417 (Dec, 1973).

16. S. H. Leem et al., Nucleic Acids Res 31, e29 (Mar 15,

2003).

17. V. N. Noskov, T. H. Segall-Shapiro, R. Y. Chuang,

Nucleic Acids Res 38, 2570 (May 1).

18. M. Itaya, K. Tsuge, M. Koizumi, K. Fujita, Proc Natl

Acad Sci U S A 102, 15971 (Nov 1, 2005).

19. M. Itaya, FEBS Lett 362, 257 (Apr 10, 1995).

20. H. Mizoguchi, H. Mori, T. Fujio, Biotechnol Appl

Biochem 46, 157 (Mar, 2007).

21. J. Y. Chun et al., Nucleic Acids Res 35, e40 (2007).

22. H. H. Wang et al., Nature 460, 894 (Aug 13, 2009).

23. A. S. Khalil, J. J. Collins, Nat Rev Genet 11, 367 (May).

24. A mycoplasma cell, with a cell mass of about 10-13 g,

contains fewer than 106 molecules of protein. (If it

contains 20% protein this is 2 x 10-14 g protein per cell. At

a molecular weight of 120 Daltons per amino acid residue

each cell contains (2 x 10-14)/120 = 1.7 x 10-16 moles of

peptide residues. This is 1.7 x 10-16 x 6 x 1023 = 1 x 108

residues per cell. If the average size of a protein is 300

residues then a cell contains about 3 x 105 protein

molecules.) After 20 cell divisions the number of progeny

exceeds the total number of protein molecules present in

the recipient cell. So, following transplantation and

replication to form a colony on a plate, most cells will

contain no protein molecules that were present in the

original recipient cell.

25. M. K. Cho, D. Magnus, A. L. Caplan, D. McGee, Science

286, 2087 (Dec 10, 1999).

26. M. S. Garfinkel, D. Endy, G. E. Epstein, R. M. Friedman.

(2007).

27. D. G. Gibson et al., Nat Methods 6, 343 (May, 2009).

28. We thank Synthetic Genomics, Inc. for generous funding

of this work. We thank J. B. Hostetler, D. Radune, N. B.

Fedorova, M. D. Kim, B. J. Szczypinski, I. K. Singh, J. R.

Miller, S. Kaushal, R. M. Friedman, and J. Mulligan for

their contributions to this work. Electron micrographs

were generously provided by T. Deerinck and M. Ellisman

of the National Center for Microscopy and Imaging

Research at the University of California at San Diego.

J.C.V. is Chief Executive Officer and Co-Chief Scientific

Officer of SGI. H.O.S. is Co-Chief Scientific Officer and

on the Board of Directors of SGI. C.A.H. is Chairman of

the SGI Scientific Advisory Board. All three of these

authors and JCVI hold SGI stock. JCVI has filed patent

applications on some of the techniques described in this

paper.

Supporting Online Material

http://www.sciencemag.org/cgi/content/full/science.1190719/DC1

Materials and Methods

Figs. S1 to S6

Tables S1 to S7

References

9 April 2010; accepted 13 May 2010

Published online 20 May 2010; 10.1126/science.1190719

Include this information when citing this paper.

Fig. 1. The assembly of a synthetic M. mycoides genome in

yeast. A synthetic M. mycoides genome was assembled from

1,078 overlapping DNA cassettes in three steps. In the first

step, 1,080-bp cassettes (orange arrows), produced from

overlapping synthetic oligonucleotides, were recombined in

sets of 10 to produce one hundred nine ~10-kb assemblies

(blue arrows). These were then recombined in sets of 10 to

produce eleven ~100-kb assemblies (green arrows). In the

final stage of assembly, these eleven fragments were

recombined into the complete genome (red circle). With the

exception of 2 constructs that were enzymatically pieced

together in vitro (27) (white arrows), assemblies were carried

out by in vivo homologous recombination in yeast. Major

variations from the natural genome are shown as yellow

circles. These include 4 watermarked regions (WM1-WM4),

a 4-kb region that was intentionally deleted (94D), and

elements for growth in yeast and genome transplantation. In

addition, there are 20 locations with nucleotide

polymorphisms (asterisks). Coordinates of the genome are

relative to the first nucleotide of the natural M. mycoides

sequence. The designed sequence is 1,077,947 bp. The

locations of the Asc I and BssH II restriction sites are shown.

Cassettes 1 and 800-810 were unnecessary and removed from

the assembly strategy (11). Cassette 2 overlaps cassette 1104

and cassette 799 overlaps cassette 811.

Fig. 2. Analysis of the assembly intermediates. (a) Not I and

Sbf I double restriction digestion analysis of assembly 341-

350 purified from E. coli. These restriction enzymes release

the vector fragments (5.5 kb and 3.4 kb) from the 10-kb

insert. Insert DNA was separated from the vector DNA on a

0.8% E-gel (Invitrogen). M indicates the 1-kb DNA ladder

(New England Biolabs; NEB). (b) Analysis of assembly 501-

600 purified from yeast. The 105-kb circles (100-kb insert

plus 5-kb vector) were separated from the linear yeast

chromosomal DNA on a 1% agarose gel by applying 4.5

V/cm for 3 hours. S indicates the BAC-Tracker supercoiled

DNA ladder (Epicentre). (c) Not I restriction digestion

analysis of the eleven ~100-kb assemblies purified from

yeast. These DNA fragments were analyzed by FIGE on a 1%

agarose gel. The expected insert size for each assembly is

indicated. . indicates the lambda ladder (NEB). (d) Analysis

of the 11 pooled assemblies shown in (c) following

topological trapping of the circular DNA and Not I digestion.

One fortieth of the DNA used to transform yeast is

represented.

Fig. 3. Characterization of the synthetic genome isolated from

yeast. (a) Yeast clones containing a completely assembled

synthetic genome were screened by multiplex PCR with a

primer set that produces 11 amplicons; one at each of the 11

assembly junctions. Yeast clone sMmYCp235 (235)

produced the 11 PCR products expected for a complete

genome assembly. For comparison, the natural genome

extracted from yeast (WT) was also analyzed. PCR products

were separated on a 2% E-gel (Invitrogen). L indicates the

100-bp ladder (NEB). (b) The sizes of the expected Asc I and

BssH II restriction fragments for natural (WT) and synthetic

(Syn235) M. mycoides genomes. (c) Natural (WT) and

synthetic (235) M. mycoides genomes were isolated from

yeast in agarose plugs. In addition, DNA was purified from

the host strain alone (H). Agarose plugs were digested with

Asc I or BssH II and fragments were separated by clamped

homogeneous electrical field (CHEF) gel electrophoresis.

Restriction fragments corresponding to the correct sizes are

indicated by the fragment numbers shown in (b).

Fig. 4. Characterization of the transplants. (a) Transplants

containing a synthetic genome were screened by multiplex

PCR with a primer set that produces 4 amplicons; one internal

to each of the four watermarks. One transplant (syn1.0)

originating from yeast clone sMmYCp235 was analyzed

alongside a natural, non-synthetic genome (WT) transplanted

out of yeast. The transplant containing the synthetic genome

produced the 4 PCR products whereas the WT genome did

not produce any. PCR products were separated on a 2% E-gel

(Invitrogen). (b) Natural (WT) and synthetic (syn1.0) M.

mycoides genomes were isolated from M. mycoides

transplants in agarose plugs. Agarose plugs were digested

with Asc I or BssH II and fragments were separated by CHEF

gel electrophoresis. Restriction fragments corresponding to

the correct sizes are indicated by the fragment numbers

shown in Fig. 3b.

Fig. 5. Images of M. mycoides JCVI-syn1.0 and WT M.

mycoides. To compare the phenotype of the JCVI-syn1.0 and

non-YCp WT strains, we examined colony morphology by

plating cells on SP4 agar plates containing X-gal. Three days

after plating, the JCVI-syn1.0 colonies are blue because the

cells contain the lacZ gene and express beta-galactosidase,

which converts the X-gal to a blue compound (a). The WT

cells do not contain lacZ and remain white (b). Both cell

types have the fried egg colony morphology characteristic of

most mycoplasmas. EMs were made of the JCVI-syn1.0

isolate using two methods. (c) For scanning EM, samples

were post-fixed in osmium tetroxide, dehydrated and critical

point dried with CO2, and visualized using a Hitachi SU6600

SEM at 2.0 keV. (d) Negatively stained transmission EMs of

dividing cells using 1% uranyl acetate on pure carbon

substrate visualized using JEOL 1200EX CTEM at 80 keV.

To examine cell morphology, we compared uranyl acetate

stained EMs of M. mycoides JCVI-syn1.0 cells (e) with EMs

of WT cells made in 2006 that were stained with ammonium

molybdate (f). Both cell types show the same ovoid

morphology and general appearance. EMs were provided by

Tom Deerinck and Mark Ellisman of the National Center for

Microscopy and Imaging Research at the University of

California at San Diego.

Table 1. Genomes that have been assembled from 11 pieces and successfully transplanted. Assembly 2-100 = 1, assembly 101-

200 = 2, assembly 201-300 = 3, assembly 301-400 = 4, assembly 401-500 = 5, assembly 501-600 = 6, assembly 601-700 = 7,

assembly 701-799 = 8, assembly 811-900 = 9, assembly 901-1000 = 10, assembly 1001-1104 = 11. WM indicates watermarked

assembly.

Genome Assembly

Synthetic Fragments

Natural Fragments

Reconstituted natural genome

None

1-11

2/11 semi-synthetic genome with 1 watermark

5WM, 10

1-4, 6-9, 11

8/11 semi-synthetic genome without watermarks

1-4, 6-8, 11

5, 9, 10

9/11 semi-synthetic genome without watermarks

1-4, 6-8, 10-11

5, 9

9/11 semi-synthetic genome with 3 watermarks

1, 2WM, 3WM, 4, 6, 7WM, 8, 10-11

5, 9

10/11 semi-synthetic genome with 3 watermarks

1, 2WM, 3WM, 4, 5WM, 6, 7WM, 8, 10-11

9

11/11 synthetic genome, 811-820 correction of dnaA

1, 2WM, 3WM, 4, 5WM, 6, 7WM, 8, 9-11

None

11/11 synthetic genome, 811-900 correction of dnaA

1, 2WM, 3WM, 4, 5WM, 6, 7WM, 8, 9-11

None

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