Le differenze trovate e gli errori commessi prima di riuscire

Tutte le differenze che apparivano biologicamente significative tra CP001668 e in precedenza cassette di sintesi sono stati corretti in modo che corrisponda esattamente (11). le differenze di sequenza tra le nostre cassette di sintesi e CP001668 che si sono verificati in 19 siti apparso innocuo, e così non sono stati corretti. Questi forniscono 19 polimorfica differenze tra il nostro genoma sintetico (JCVI-syn1.0) e la naturale (non sintetici) genoma (YCpMmyc1.1) che abbiamo hanno clonato nel lievito e utilizzare come standard per genoma trapianto da lievito (8). Per differenziare ulteriormente tra il genoma sintetico e quello naturale, quattro sequenze di filigrana (fig. S1) sono stati progettati per sostituire una o cassette di più nelle regioni dimostrato sperimentalmente (Filigrane 1 [1246 bp] e 2 [1081 BP]) o la prevedibile (Filigrane 3 [1.109 bp] e 4 [1.222 bp]) non interferire con la vitalità cellulare. Queste sequenze filigrana codificare unico identificatori, pur limitando la loro traduzione in peptidi. Tavolo S1 elenca le differenze tra il genoma sintetico e questo standard naturale. Figura S2 mostra una mappa del M. mycoides JCVI-syn1.0 genoma. Casette e assemblaggio intermedio confini, filigrane, delezioni, inserzioni, e geni il M. mycoides JCVI syn1.0 sono mostrati in fig. S2, e il sequenza del clone micoplasma trapiantatosMmYCp235-1 è stato presentato alla GenBank (adesione # CP002027). pSynthetic strategia di assemblaggio del genoma Le cassette sono state generalmente progettate 1.080 bp a 80 bp sovrappone a cassette adiacenti (11). Essi sono stati tutti prodotti da assemblaggio di oligonucleotidi sintetizzati chimicamente da Blue Heron, Bothell, Washington. Ogni cassetta è stata individualmente sintetizzato e sequenza verificato dal costruttore. A aiuto nel processo di costruzione, cassette di DNA e l’assemblaggio intermedi sono stati progettati per contenere Non ho siti di restrizione a loro termini, e ricombinati alla presenza del vettore elementi per consentire la crescita e la selezione in lievito (7) (11). pA strategia gerarchica è stato progettato per assemblare il genoma in 3 fasi per la trasformazione e omologhi ricombinazione in lievito 1.078 cassette da un kb (Fig. 1) (12, 13). Assemblea degli intermedi sintetici di 10 kb. Nel primo fase, cassette e un vettore sono stati ricombinati in lievito e trasferiti a E. coli (11). DNA del plasmide è stato quindi isolato da singoli cloni di E. coli e digerito allo schermo per le cellule contenente un vettore con un inserto montato 10-kb. Uno successo di montaggio di 10 kb è rappresentato (Fig. 2a). In generale, almeno un frammento di 10 kb potrebbe essere assemblata ottenuti dallo screening 10 cloni di lievito. Tuttavia, il tasso di successo varia dal 10-100%. Tutte le prima fase intermedi sono stati sequenziati. Diciannove su 111 assemblee conteneva errori.

Tutte le differenze che apparivano biologicamente significative tra CP001668 e in precedenza cassette di sintesi sono stati corretti in modo che corrisponda esattamente (11). le differenze di sequenza tra le nostre cassette di sintesi e CP001668 che si sono verificati in 19 siti apparso innocuo, e così non sono stati corretti. Questi forniscono 19 polimorfica differenze tra il nostro genoma sintetico (JCVI-syn1.0) e la naturale (non sintetici) genoma (YCpMmyc1.1) che abbiamo hanno clonato nel lievito e utilizzare come standard per genoma trapianto da lievito (8). Per differenziare ulteriormente tra il genoma sintetico e quello naturale, quattro sequenze di filigrana (fig. S1) sono stati progettati per sostituire una o cassette di più nelle regioni dimostrato sperimentalmente (Filigrane 1 [1246 bp] e 2 [1081 BP]) o la prevedibile (Filigrane 3 [1.109 bp] e 4 [1.222 bp]) non interferire con la vitalità cellulare. Queste sequenze filigrana codificare unico identificatori, pur limitando la loro traduzione in peptidi. Tavolo S1 elenca le differenze tra il genoma sintetico e questo standard naturale. Figura S2 mostra una mappa del M. mycoides JCVI-syn1.0 genoma. Casette e assemblaggio intermedio confini, filigrane, delezioni, inserzioni, e geni il M. mycoides JCVI syn1.0 sono mostrati in fig. S2, e il sequenza del clone micoplasma trapiantatosMmYCp235-1 è stato presentato alla GenBank (adesione # CP002027). pSynthetic strategia di assemblaggio del genoma Le cassette sono state generalmente progettate 1.080 bp a 80 bp sovrappone a cassette adiacenti (11). Essi sono stati tutti prodotti da assemblaggio di oligonucleotidi sintetizzati chimicamente da Blue Heron, Bothell, Washington. Ogni cassetta è stata individualmente sintetizzato e sequenza verificato dal costruttore. A aiuto nel processo di costruzione, cassette di DNA e l’assemblaggio intermedi sono stati progettati per contenere Non ho siti di restrizione a loro termini, e ricombinati alla presenza del vettore elementi per consentire la crescita e la selezione in lievito (7) (11). pA strategia gerarchica è stato progettato per assemblare il genoma in 3 fasi per la trasformazione e omologhi ricombinazione in lievito 1.078 cassette da un kb (Fig. 1) (12, 13). Assemblea degli intermedi sintetici di 10 kb. Nel primo fase, cassette e un vettore sono stati ricombinati in lievito e trasferiti a E. coli (11). DNA del plasmide è stato quindi isolato da singoli cloni di E. coli e digerito allo schermo per le cellule contenente un vettore con un inserto montato 10-kb. Uno successo di montaggio di 10 kb è rappresentato (Fig. 2a). In generale, almeno un frammento di 10 kb potrebbe essere assemblata ottenuti dallo screening 10 cloni di lievito. Tuttavia, il tasso di successo varia dal 10-100%. Tutte le prima fase intermedi sono stati sequenziati. Diciannove su 111 assemblee conteneva errori.