Come hanno operato
Come hanno operatoPer purificare ulteriormente le 11 assemblea intermedi, sono stati trattati con exonuclease e passato attraverso una colonna a scambio anionico. Una piccola frazione del totale di DNA del plasmide (1/100th) è stato digerito con Not I e analizzati mediante elettroforesi su gel a campo-inversione (FIGE) (Fig. 2c). Questo metodo produce ~ 1 mg di ogni assemblea per 400 lievito madre ml (~ 1011 celle). Il metodo di cui sopra non rimuove completamente tutti i lievito DNA cromosomico lineare, che abbiamo trovato possa ridurre notevolmente la trasformazione del lievito e il montaggio efficienza. Per arricchire ulteriormente per l’assemblaggio undici circolare intermedi, ~ 200 campioni ng di ogni assemblea sono stati riunite e mescolate con agarosio fuso. Come l’agarosio solidifica, il filo attraverso le fibre e topologicamente “trappola” DNA circolare (15). DNA non catturato lineare può essere elettroforesi su agarosio la spina, arricchendo così la intrappolate molecole circolari. L’assemblea undici circolare intermedi sono stati digeriti con Non io in modo che gli inserti potrebbe essere rilasciato. Successivamente, i frammenti sono stati estratta dalla presa di agarosio, analizzata da FIGE (Fig. 2d), e trasformata in sferoplasti lievito (11). In questa terza e fase finale di montaggio, una sequenza di vettore aggiuntivo non è stato richiesto, poiché il lievito clonazione elementi sono stati già presenti in assemblea 811-900. Per schermo per un genoma completo, PCR multiplex è stata effettuato con 11 coppie di primer, progettato per occupare ciascuno dei undici svincoli di montaggio di 100 kb (S3 tabella). Di 48 colonie schermato, DNA estratto da un clone (sMmYCp235) prodotte tutte le 11 ampliconi. PCR di tipo selvatico (WT) controllo positivo (YCpMmyc1.1) ha prodotto un insieme indistinguibile di 11 ampliconi (Fig. 3a). Per ulteriori dimostrare l’assemblaggio completo di un sintetico M. mycoides genoma, il DNA intatto è stato isolato da lievito in spine agarosio e sottoposto a due analisi di restrizione; Asc I BssH e II (11).
Dato che questi siti di restrizione sono presenti in tre delle quattro sequenze di filigrana, questa scelta di digestione produce modelli di restrizione che si distinguono dai il naturale M. mycoides genoma (figg. 1 e 3b). Il clone prodotto il profilo di restrizione attesi per un genoma sintetico completamente montato (Fig. 3c). pSynthetic trapianto di genoma spine agarosio Ulteriori utilizzati per l’analisi di gel sopra (Fig.3c ) sono stati utilizzati anche in esperimenti di trapianto del genoma ). Intatto genomi sintetici M. mycoides dalsMmYCp235 clone lievito sono stati trapiantati in restrictionminus M. capricolum cellule riceventi, come descritto (8). Risultati sono stati segnati da selezionare per la crescita di colonie blu sulla SP4 supporto contenente tetraciclina e X-gal a 37 ° C. Genomi isolati da questo clone lievito ottenuto tetracyclineresistant 5-15 colonie blu per agarosio spina. Questo è stato comparabile al controllo YCpMmyc1.1. Il recupero delle colonie in tutti i esperimenti di trapianto è stato dipendente dalla presenza di entrambe le celle M. destinatario capricolum e un M. mycoides genoma. Semi-sintetico di assemblaggio e il trapianto di genoma Per facilitare la verifica della funzionalità di ogni 100 kb sintetico genomi segmento, semi-sintetico sono state costruite e trapiantati. Miscelando pezzi naturali con quelli sintetici, la costruzione di successo di ogni assemblea sintetico da 100 kb hanno potuto essere verificate, senza dover sequenza di queste intermedi. Abbiamo clonato 11 sovrapposizione naturale da 100 kb assemblee in lievito utilizzando un metodo precedentemente descritto (16). In 11 reazioni parallele, cellule di lievito sono stati co-trasformato con M. mycoides frammentato genomic DNA (YCpMmyc 1.1) che in media ~ 100 kb di lunghezza e una PCR-amplificato vettore progettati per sovrapporsi alle estremità degli inserti di 100 kb. A mantenere le sovrapposizioni appropriate affinché naturali e sintetici frammenti possono essere ricombinati, i vettori PCR-amplificato sono stati prodotti tramite iniettori con le sovrapposizioni di 40 bp stesso usato per clonare le assemblee di 100 KB di sintesi.
Il semi-sintetico genomi che sono stati costruiti contenuta tra due e dieci degli undici sottoinsiemi di 100 kb di sintesi (tabella 1). La produzione di colonie vitali prodotti dopo trapianto, ionfirmed che la frazione di sintesi di ogni genoma non contiene mutazioni letali. Solo uno dei 100 – sottoinsiemi kb, 811-900, non era praticabile. Inizialmente, un messaggio di errore contenente 811-820 clone è stato utilizzato per produrre un genoma sintetico che non il trapianto. Questo è stato atteso poiché l’errore è stato un unico cancellazione coppia di basi che crea un frameshift in dnaA, un gene essenziale per replicazione dei cromosomi. Eravamo già a conoscenza di questa mutazione. Utilizzando una costruzione semi-sintetico del genoma strategia, siamo stati in grado di individuare 811-900 come fonte di fallito esperimenti di trapianto di sintesi. Così, abbiamo iniziato di rimontare un errore privo di 811-900 assemblea, che è stato utilizzati per produrre lo sforzo sMmYCp235 lievito. Il dnaAmutated genoma differisce solo per un nucleotide del genoma sintetico in sMmYCp235. Questo genoma servito da controllo negativo nei nostri esperimenti di trapianto. Il dnaA mutazione è stata riparata anche a livello di 811-900 da genoma ingegneria nel lievito (17). Un assembly è stato riparato 811-900 utilizzato in una fase finale di assemblaggio per produrre un clone di lievito con un riparazione del genoma. Questo clone è chiamato lievito sMmYCP142 e potrebbero essere trapiantati. Un elenco completo dei genomi chesono stati assemblati da 11 pezzi e con successo trapiantato è previsto nella tabella 1. Caratterizzazione dei trapianti di sintesi Per distinguere rapidamente i trapianti di sintesi provenienti da M. capricolum o naturale mycoides M., due analisi sono state eseguita. In primo luogo, quattro coppie di primer che sono specifici per ciascuna delle i quattro filigrane sono stati progettati in modo tale che essi producono ampliconi quattro in una singola reazione di PCR multiplex (tabella S4).
Tutti e quattro gli ampliconi sono stati prodotti da trapianto generata da sMmYCp235, ma non YCpMmyc1.1 (Fig. 4a). In secondo luogo, l’analisi gel con Asc I e II BssH, descritto in precedenza (Fig. 3D), è stata effettuata. Il pattern di restrizione ottenuto è stato coerente con un trapianto di prodotto da un sintetico M. mycoides genoma (Fig. 4b). Un trapianto singolo provenienti dal sMmYCp235 genoma sintetico è stato sequenziato. Ci riferiamo a questo ceppo di M. mycoides JCVI-syn1.0. La sequenza ha riscontrato l’intesa design con l’eccezione dei polimorfismi noti, 8 nuovi polimorfismi di singoli nucleotidi, un trasposone E. coli inserimento, e di una duplicazione di 85 bp (tabella S1). I trasposoni inserimento corrisponde esattamente la dimensione e la sequenza di IS1, un trasposone in E. coli. E ‘probabile che IS1 infetto il 10-KB sub-assemblaggio seguito del suo trasferimento in E. coli. L’inserto IS1 è fiancheggiata da ripetizioni dirette di M. mycoides sequenza suggerendo che è stato inserito da un meccanismo di recepimento. La duplicazione di 85 bp è il risultato di un non-omologa end giunzione evento, che non è stata rilevata nella nostra sequenza analisi in fase di 10 kb. Questi due inserimenti disturbare due geni che sono evidentemente non essenziali. Non abbiamo trovato alcuna le sequenze del genoma sintetico che potrebbe essere identificata come appartenenti a capricolum M.. Questo indica che c’è stato un la sostituzione completa del genoma di M. capricolum dal nostro genoma sintetico durante il processo di trapianto. Le celle con solo il genoma sintetico sono auto replica e capace di una crescita logaritmica. Scansione e microscopio elettronico a trasmissione (EM) di M. mycoides JCVI-syn1.0 celle mostrano piccole celle ovoidale circondato da membrane citoplasmatica (Fig. 5c-5F). Analisi di proteomica M. mycoides JCVI-syn1.0 e il WT di controllo (YCpMmyc1.1) di due-dimensionale elettroforesi su gel rivelato pressoché identico pattern di macchie proteine (fig. S4) e questi erano chiaramente diversi da quelli precedentemente riportati per capricolum M. (10). Quattordici i geni sono soppresse o interrotto in M. mycoides JCVI-syn1.0 genoma, Tuttavia, il tasso di comparsa di colonie su piastre di agar e la morfologia delle colonie sono simili (confronta fig. 5a e b). Abbiamo fatto osservare differenze nei tassi di crescita in un colore fasciatoio test, con la JCVI-syn1.0 trapianti crescita leggermente più veloce rispetto al controllo MmcyYCp1.1 ceppo (Fig. S6)
